Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения рас­творов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыво­ротка Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, фор­мирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей за­висимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах. Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции КЛОНОВ С ВЫСО­КОЙ степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма.

Реакция связывания комплемента

Ингредиенты: Сыворотка больного 1:5 25мл.; Антиген в рабочей дозе (диагностикум) 25мл.; комплемент 25мл.; «+» иммунная сыворотка для пол.контроля 25мл.; «-« сыворотка для отрицательного контроля; физ.р-р 25мл.; гемолитическая система (эритроциты барана, иммунная сыворотка содержащая антитела к этим эритроцитам) 50мл.; все компоненты титруются

Условия: строгое участие и подбор всех компонентов; поочередное внесение ингредиентов; физ.р-р.; использование «+» м качеств.реакции

Комплемент в рабочей дозе берется в 3 раза <, чем определяемый титр комплемента.

После внесения антигена к сыворотке комплемента 37 °С на 1 час. Реакция ставится в парных сыворотках через 10 и 20 дней, после начала заболевания. Сущность: АГ+АТ+КОМПЛИМЕНТ.

Реакция протекает в две фазы с участием двух систем: бактери­альной и гемолитической.

В первой реакции (специфической) участвуют антиген + ан­титело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соот­ветствии антител антигену, характеризуется образованием спе­цифического бактериального комплекса антиген - антитело с ад­сорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался.

Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного ком­племента.

Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1-2 ч) или в холодильнике при 3-4°С (18-20 ч).

При длительном образовании иммунного комплекса антиген - антитело на холоде происходит более полное связывание ком­племента и вследствие этого чувствительность реакции увеличи­вается.

Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реа­гентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная).

При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не на­ступает (реакция положительная).

Реакцию связывания комплемента можно применять для сле­дующих целей:

1. выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной при­роды;

2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфиче­ской сывороткой

PCK используется для лабораторной диагностики венерических заболеваний, риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, клещевой энцефалит и др.) и основывается на спо­собности комплемента связываться с комплексом АГ + AT. Комплемент адсорбируется fс-фрагменте иммуноглобулинов G и М. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимо­действие антигена и антитела. В качестве материала, содержащего антитела, используется ис­следуемая сыворотка, к которой добавляется известный антиген. К этой системе добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37°С в течение одного часа.

Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитиче­ской системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемоли­зины к эритроцитам барана). К смеси антиген + антитело + комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37°С в течение 30 - 60 мин, после чего оце­нивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + AT, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в ис­следуемой сыворотке содержатся специфические антитела к диагностическому антигену. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител, комплекс АГ + AT не образует­ся и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по ЧеТЫреХКреСТНОЙ СИСТеме В ЗаВИСИМОСТИ ОТ степени Задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов.