8.3.2. Гель-хроматография смеси на колонке Сефадекса g – 50

Принцип метода: Разделение смесей этим способом основано с одной стороны, на различиях в размерах их молекул, а с другой - на соизмеримости разделяемых молекул с размерами пор гранул гелей (рис. 8.2). Поэтому крупные макромолекулы в поры геля не проникают и элюируются с колонок первыми. Напротив, чем мельче размеры молекул других компонентов смеси, тем чаще они попадают через поры в гранулы и, задерживаясь в колонке, выходят из нее позже, то есть в больших объемах элюата. Отсюда синонимы метода: гель-фильтрация или метод молекулярных сит.

Рис. 8.2. Схема гель-фильтрации двухкомпонентной смеси

(по http://www2.usu.ru/biology/plant_phys/posob_bio_cont.htm)

Свойства молекулярных сит имеют многие пористые материалы, начиная с природных или искусственных цеолитов, полиакриламида и пористого стекла, несжимаемых при гидростатическом давлении. Напротив, трехмерные гели агарозы и декстрана (коммерческие названия Сефадекс – Pharmacia, Швеция; Молселект – Reanal, Венгрия), благодаря высокому содержанию гидроксильных групп легко набухают, но и сжимаются при избытке давления или скорости истечения элюата, что нежелательно, во избежание регенерации колонки! Как правило, большие марки препаратов, идущих за их названием, отражают большую степень набухаемости и более крупный размер гранул, при меньшей степени их поперечной сшитости, позволяющих разделять вещества в широком диапазоне молекулярных масс.

Ход работы:

1. На входе в колонку 0,9 x 15 см, заполненную гелем Сефадекса G – 50 (Pharmacia, Швеция) удалить пробку и, контролируя положение колонки в штативе с двух взаимно перпендикулярных позиций, довести его зажимами штатива до строго вертикального.

2. Убедившись, что поверхность геля строго горизонтальна и прикрыта фильтром, отрегулировать винтовым зажимом скорость истечения элюата в стакан-приемник до 10 – 15 капель/мин.

3. Дождавшись впитывания элюента на входе в колонку, не допуская подсыхания и взмучивания носителя, пипеткой по каплям, осторожно нанести на гель 0,5 мл смеси (1:1) 0,5 % раствора декстрана голубого (M =  2000 кДа) и насыщенного раствора рибофлавина (M = 376 Да).

4. Параллельно, заменить на выходе из колонки стакан-приемник, штативом с мерной центрифужной пробиркой № 1.

5. Как только делимая смесь впитается в гель, осторожно наслоить на него 5 мл физиологического раствора (0,85 % хлорид натрия) и повторять эту процедуру в течение всего опыта (30 – 40 мл).

6. Ориентируясь на изменения цвета элюата, продвигать под колонкой штатив, собирая тем самым в центрифужные пробирки №№ 1-4, его бесцветную, голубую, бесцветную и жёлтую фракции.

7. В соответствии с Инструкцией по эксплуатации фотоэлектроколориметра модели КФК-2. (п. 4.3.1. данного пособия), включить прогрев ФЭКа.

8. Убедившись, что колонка достигла исходного состояния, снова заменить штатив стаканом-приемником и, дополнительно промыть ее 10-15 мл физраствора.

9. Перекрыть зажимом выход колонки, оставив над поверхностью геля 1,5-2 мл элюента и закрыть вход в нее пробкой.

10. Определить объёмы полученных фракций элюата и занести результаты в таблицу протокола:

Результаты гель-фильтрации смеси на колонке 0,9 х 15 см

Сефадекса G-50

11. В соответствии с вышеупомянутой (п. 7) инструкцией, измерить против воды абсорбцию полученных фракций элюата при зеленом светофильтре (λ=540 нм) в кювете толщиной 5 мм, занося результаты в таблицу.

12. Построить график элюции с колонки, отложив по оси абсцисс объёмы элюата в мл, а по оси ординат – найденные величины А.

13. На основании данных эксперимента – идентифицировать компоненты исходной смеси.