9.2. Задание на дом
9.2.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 10 вспомните, что значит понятие дзета-потенциал?
9.2.2. Какие типы электрокинетических явлений Вам известны и, где и как их применяют?
9.2.3. Попытайтесь определить понятие электрофорез.
9.2.4. Чем отличается свободный электрофорез от зонного?
9.2.5. Какие материалы применяют для электрофореза в зоне и в чем разница между ними?
9.2.6. Какие достоинства и недостатки вы видите у электрофореза в гелевых средах?
9.2.7. Что вы знаете о происхождении, функциях и применении белков плазмы крови?
9.2.8. Исходя из представлений об организмах, как открытых системах, расскажите, как классифицируют организмы по типам обмена веществом и энергией с окружающей средой?
9.2.9. Определите понятие «метаболизм» и, в соответствии со стандартной трехэтапной схемой, расскажите о принципах катаболизма и анаболизма.
9.2.10. Определив понятия «нутриенты» и «минорные компоненты» пищи хемоорганотрофов, расскажите об их природе, суточных потребностях и степени заменимости.
9.2.11. Что вы знаете о пищевых дефицитах, их связи с массой тела, возрастом, полом и образом жизни?
9.2.12. Чем различаются понятия «минеральные компоненты пищи», «соли», и «микроэлементы»?
9.2.13. Определите понятие «витамины». Что Вы знаете об их номенклатуре, классификации, функциях? Что такое про- и антивитамины?
9.2.14. Что Вы знает о функциях, суточных потребностях и скорости развития гипо- и гипервитаминозов для водо- и жирорастворимых витаминов?
9.2.15. Дайте краткую характеристику водорастворимых витаминов: тиамина, рибофлавина, никотинамида, пиридоксина, кобаламина, биотина, аскорбиновой, липоевой, пантотеновой и фолевой кислот.
9.2.16. Дайте краткую характеристику жирорастворимых витаминов: ретинола, кальциферола, токоферола, филлохинона и полиеновых жирных кислот.
Занятие 10. Разделение биополимеров методами электрофореза
10.1. Общие замечания. Из курса физической химии известен класс пограничных электрокинетических явлений, свойственных дисперсным системам и капиллярам (рис. 10.1). М. Smoluchowski (1872 – 1917, Польша) объяснил их (1903) возникновением дзета-потенциала, то есть избытка зарядов двойного электрического слоя на границе раздела адсорбционно связанной = неподвижной и тангенциально смещающейся подвижной = диффузионной фазы. Тот же дзета-потенциал, служит и мерой их интенсивности.
Рис. 10.1. Схема группировки пограничных процессов
Очевидно, что электрокинетические явления не только широко распространены в биосфере, но их принципы часто применяют в различных областях техники и медицины. Из них, в аналитической и диагностической биохимии чаще всего используют методы центрифугирования и электрофореза, за разработку которых, соответственно, Т. Svedberg (1926) и A.W.K. Tiselius (1948) из университета в Упсале (Швеция), удостоены Нобелевских премий по химии.
Попытки деления смесей частиц с помощью электрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали величины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.
В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода. (рис. 10.2).
Рис. 10.2. Результаты зонного электрофореза нормальной сыворотки крови человека. (По http://immunologia.narod.ru/pic20.1.htm).
На электрофореграмме (внизу) и ден-ситограмме (вверху) видны 5 основных полос и пиков, соответствующих сывороточному альбумину = СА и фракциям глобулинов.
Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод. Тем не менее, его тонкие модификации, подобные электрофорезу в гелях, изотахофорезу и изоэлектрофокусированию, удается применить и к целям получения препаратов (Скоупс, 1985). Однако автор предупреждал, что пока не освоены простейшие методики зонного электрофореза, начинающим исследователям не стоит и помышлять об этих изощренных процедурах, связанных с множеством трудностей.