Нозерн блот і мікрочіпи

Питання, яке часто виникає щодо мікрочіпів - наскільки вони надійні. Один із способів перевірки достовірності даних мікрочіпів є перевірка експресії для безлічі генів зНозерн блот. Це те, що було зроблено для одного з перших експериментів мікрочіпів виконаного в Brown і Herskowitz лабораторіях, метою якого було виявити гени, експресія яких викликана під час споруляціі в дріжджах. На правій панелі цього слайда мікрочіпів результати для чотирьох генів, які, здавалося, індуковані в різний час після початку споруляції. Червоний використовується для позначення індукцію, і зелений використовується для позначення репресій. У лівій панелі, ті ж чотири гени, які використовуються в якості зондів в Нозерн блот з РНК, виділеної в різні моменти часу після початку споруляції. Порівняння мікрочіпів і результатів Нозерн блот показує, що існує узгодження між двома методами визначення моделі експресії РНК. Загалом, це хороша ідея, щоб перевіряти результати мікрочіпів за допомогою Нозерн блот або кількісної ПЛР.

Крос-гібридизації ( перехресна гібридизація)

Гібридизації споріднені, але не ідентичні послідовності = перехресна гібридизація

Приклад: зонд від одного з членів сімейства генів, ймовірно, буде схрещуватися з усіма іншими членами

Проблеми мікрочіпів, зокрема кДНК чіпів

Олігонуклеотидні чіпи попередньо відбираються для усунення послідовностей, які дозволяють відбутися перехресній гибрідизаюції.

Основною проблемою в експериментах мікрочіпів є гібридизація двох послідовностей, які пов'язані, але не тотожні. Це відбувається, коли два члени сімейства генів, мають високо пов'язані послідовності. Це є особливо неприємною проблемою для мікрочіпів з плямистою (spotted) кДНК, тому що довгі послідовності містять більше потенційних областей подібності. Олігонуклеотидні-основи мікрочіпів намагаються мінімізувати цю проблему шляхом скринінгу геному і усуненні будь-яких олигонуклеотидів, які можуть дозволити відбутися перехресній гібридизації.

Субклонування

Поширення фрагментів клонованої ДНК

Використовується для секвенування і виробництва білків (protein production)

Плазмідний вектор

- Реплікація в бактеріях

- Стійкість до антибіотиків

- клонування сайтів

Як тільки ДНК, було виділено з організму та клоноване( тобто вставлене в вектор і ампліфіковане в бактеріях), часто доцільно передавати частину оригінальних клонів в інші вектори, це процес відомий як субклонування. Використання субклонування включає в себе секвенування і виробництво білка. Вектори використовуються для клонування і субклонування забезпечують розповсюдження і ампліфікацію ДНК. Плазміди є одним з видів клонуючого вектора, вони є круговими і містять послідовності, які дозволяють їм реплікуватися в бактерії, гени, які мають стійкість до одного або декількох антибіотиків, і місце для вставки фрагментів ДНК. Як правило, сайт для введення ДНК складається з декількох ферментів рестрикцій них сайтів, які не знайдені в інших місцях на клонуючому вектор. Ця область називається полілінкером або multicloning сайтом (MCS).