Рестрикційно-ферментне картування

Використовується для фізичного картування ДНК

Рестрикційні ферменти ріжуть визначені сайти

• паліндромні послідовності

Сайти є мітками на ДНК

Потім фрагменти розділяють гелем-електрофорезом

Рестрикційні фрагменти ( або ендонуклеази) використовуються в фізичному картуванні для визначення подібності між ділянками ДНК. Вони також використовуються в субклонуванні для забезпечення сумісності кінців. Характерною рисою ферментів рестрикції для картування є те, що вони ріжуть на конкретних сайтах, які зазвичай складаються з паліндромних послідовностей. (Приклад показаний на слайді, показані сайти розрізання). Ці сайти представляють собою мітки на ДНК, і відстань між двома точками може бути використана в якості діагностики для визначення наявності того чи іншого регіону ДНК. Розташування ділянок визначають шляхом розрізання ДНК, а потім розділення отриманих фрагментів за допомогою процесу, відомого як гель-електрофорез.

Гель-електрофорез

Фрагменти ДНК розділяються за розміром в електричному полі

ДНК негативно заряджені: пропорційні розміру фрагмента

Розділення через гелеву матрицю

• агароза або акріламід

Гель-електрофорез використовує електричне поле, щоб відокремити фрагменти ДНК за розміром. Фосфатні групи в основі ДНК забезпечують негативний заряд, який рівномірно розподілений, і таким чином ДНК має постійний співвідношення заряду до маси. Іншими словами, чим довша ділянка ДНК, тим більше негативний заряд. ДНК завантажується в лунки, утворені в гелевій матриці. Матриця може бути зроблено або з агарози або з акриламіду. Обидва типи матриць роблять за тим же принципом: вони перешкоджають руху ДНК, коли воно намагається рухатися до позитивного полюса електричного поля. Малі молекули здатні рухатися швидше через гель, а більші молекули більш повільно.

Розрізання вас резтрикційними ферментами

Окремі фрагменти ДНК вирізаються рестриктазою

ДНК візуалізують з бромистим етидієм

- Зв'язується з ДНК і флуоресціює оранжевим

Розміри фрагментів визначається на основі стандартних

У даному прикладі рестрикційного картування, очищене ДНК від концентрації алкоголю в крові було оброблене одним із таких способів: Лунка 1 - нерозрізаний BAC ДНК; Лунка 2 – розрізаний рестрикцій ним ферментом Not I, який має вісім пар основ визначеного сайта і таким чином порізаний дуже рідко; Лунка 3 – розрізаний Eco RI рестріктазою; Лунка 4 – розрізаний ферментом рестрикції Hind III. Зверніть увагу на різні смуги для Eco RI-Cut ДНК і Hind III-Cut ДНК. Фрагменти ДНК візуалізували шляхом фарбування бромистим етидієм, який зв'язується з ДНК і флуоресціює жовтим при освітленні ультрафіолетовим світлом. Лунка "М" має маркер, що містить набір фрагментів ДНК відомого розміру. Положення цих маркерів фрагментів використовується для визначення розмірів фрагментів в інших лунка. Це робиться шляхом побудови відстані мігрування в порівнянні з логарифмом молекулярної маси маркерів (як в слайді). Коли потрібно визначити розмір невідомого фрагмента , його молекулярна маса може бути визначена шляхом його розміщення на цій лінії. Нижня панель показує прилад геля-електрофорезу з джерелом живлення позаду нього.