Білкова експресія

Важлива для протеоміки

Потрібна велика кількості рекомбінантних білків для наступних цілей:

• структури визначення

• виробництва антитіл

• білкових чіпів

Білки, зроблені в бактеріях, дріжджах і клітинах комах

Очистиска рекомбінантних білків від інших білків

Для протеомного аналізу, часто необхідно мати велику кількість рекомбінантного білка. Наприклад, кристалографічні та NMR структури білка визначення вимагає виробництва й очищення до мкг масштабах кількісті білка. Рекомбінантний білок також використовується для виробництва антитіл і білкових чіпів . Є кілька добре вивчених систем для створення рекомбінантних білків, в тому числі бактерії, дріжджі і клітини комах. Після того, як клітини накопичують рекомбінантний білок, він повинен бути очищений від інших білків, що виявлені в клітині.

Білково-експресуючі вектори

Білково-експресуючі вектори мають наступне:

- індуковані промотори

- Теги для очищення

---гістидини

---епітопи

---білки

Кодуючі послідовності вставляються в рамку

Через накопичення чужорідних білків можуть бути токсичні, більшість векторів експресії білка мають індуковані промотори. Промотери дозволяють клітинам ділитися і розмножуватися без чужорідного білка. Коли клітини досягли високої щільності, рекомбінантні білки можуть бути індуковані і зібрані. Щоб допомогти в очищенні, більшість векторів експресії містять ряд амінокислот, які додають в білок. Ця додаткова послідовність білка відома як теги і відіграє важливу роль в очищенні рекомбінантного білка. Існують різні типи тегів, що використовуються в білкових експресуючих векторах. Популярні теги включають ряд гістидину відомого як His-тег, який буде зв'язуватися з колонками нікелю, епітопи, які можуть визначати моноклональні антитіла, такі як Myc, і теги, що містять білки, такі як мальтоза-зв'язуючий білок, який може бути очищають, пропускаючи через колонку цукор мальтози. Одна з причин для різних тегів в тому, що різні мітки можуть змінити розчинність рекомбінантного білка по-різному. Для тегів, щоб стати частиною рекомбінантних білків, кодуюча послідовність повинна бути вставлена в рамку з ним.

Створення рекомбінантних білків

Експресійний вектор трансформується в бактерії

Бактерії виростають до насичення

Compound added for induction

e.g., IPTG

Білки накопичується в бактерії

Після лігування білок-кодуючі послідовності в вектор експресії, наступним кроком є трансформація бактерій. Бактерії містять білки, які контролюються індукованим промотором. Бактерії можуть рости до рівня насичення, не роблячи ніяких рекомбінантних білків. Як тільки вони досягають насичення, що викликають молекули, такі як IPTG доданий. Ця молекула викликає активує промотер, і рекомбінантний білок починає накопичуватися в бактеріях.

Очищення білків

Contents of bacteria run over column ??

Білкові мітки зв’язуються з колонками

Приклади:

Nickel column for His-tagged proteins

Anti-myc antibody column for Myc-tagged proteins

Елюювання дає очищення білків

На наступному етапі рекомбінантного білка виробництва, бактерії лізуються, а витягнутий білок запускається через колонку. Визначені рекомбінантні білки зв'язуються з колонкою. У разі His-мічених білків, як показано на слайді, стовпець містить нікель, який буде пов'язувати позитивно заряджені його залишки. Для FLAG-або Myc-мічених білків, стовпець містить антитіла, специфічні до FLAG- чи Myc епітопа. Після того, змиваючи всі незв'язані білки, рекомбінантні білки вимивається з колонки, отримуючи відносно чистий білок.