Субклонування: вектор і фрагмент

Вектор і фрагмент, що вставляється повинні мати сумісні кінці

Липкі кінці відпалу

Ферменти-лігази роблять ковалентними зв'язки між вектором і фрагментом

Використання рекомбінації замість сайтів рестрикції

Перший крок в субклонуванні є укорочення фрагмента ДНК і клонуючого вектора такими ж ферментами рестрикції. Цей крок буде гарантувати, що вони будуть мати сумісні кінці. Є багато варіацій на цю тему. На обох кінцях фрагменту можуть бути укорочені тим самим ферментом рестрикції, або два кінця можуть бути укорочені різними ферментами рестрикції. Перевага урізання різних ферментів в тому, що фрагмент може бути вставлений в клонований вектор із заданою орієнтацією. Також можна клонувати фрагмент, який має тупі кінці, такі як в випадково розрізаної ДНК. Перевага липких кінців від більшості ферментів рестрикції в тому, що реакція протікає більш ефективно, ніж у випадку з тупими кінцями. Фермент лігаза, що виділений з бактеріофага Т4, використовується, щоб зробити ковалентні зв'язків між відпаленим фрагментом ДНК і клонуючим вектором. Альтернатива лігування полягає у використанні сайт-специфічної рекомбінації. Цей метод набуває широкого застосування в галузі геноміки через свою універсальність.

Рекомбінаційне клонування

Використовує сайт-специфічну рекомбінацію для субклонування

Фрагмент ДНК в оточенні рекомбінаційних сайтів

Додавання рекомбінази “Clonase®”

Переміщення фрагмента з одного вектора в інший

Перевага використання рекомбінації замість сайтів рестрикції є те , що як тільки фрагмент ДНК клонували, він може бути переміщений з легкістю в різні вектори. Наприклад, коли новий ген ізолювали, досліднику часто потрібна його послідовність, експресія білка, зробити злиття генів і знову ввести їх в організм. При рекомбінаційні системі, такі як Gateway system , що розроблена Invitrogen після того, як ген клонували в "вхідний вектор," субклонування в експресуючий вектор або вектора послідовності є дуже простим. Основна ідея полягає в тому, що рекомбіназа (відомою як Clonase ® в Gateway ™ система) визнає коротку ділянку ДНК в якості майданчика для рекомбінації. Коли ген інтереса є в оточенні цих сайтів і інший вектор включає такі ж сайти, рекомбіназа буде рухати гени від одного вектора на інший. Після введення в бактерії, це другий вектор може бути вибраний як маркер стійкості до антибіотика, що він несе.

Трансформація в бактерії

Бактерії готують до трансформації роблячи їх зовнішню мембрану проникну для ДНК

• стати компетентним ( компетентні клітини)

ДНК додають до бактерій

Тепловий шок

Сіють на селективне середовища

Щоб отримати бактерії, які можуть пропускати в себе ДНК, цей процес вимагає підготовки, метою якого є зробити зовнішню оболонку бактерій проникними для ДНК. Цей препарат призводить що бактерія стає "компетентною" для перетворення і бактерії тоді називаються компетентними клітинами. Ліговану ДНК додають до суспензії компетентних клітин і дозволяють приєднатися до їх поверхні. Тоді короткочасно впливають підвищеним теплом це відомо як тепловий шок, допомагає поглинанню ДНК бактеріям. Бактерії можуть відновитися протягом короткого часу в живильному середовищі, а потім вони поширюються на середовищі, що містить антибіотик. Цей процес відомий як покриття на селективних середовищах. Антибіотик поширюється так само, як клонуючий вектора, оскільки забезпечує стійкість. Таким чином, тільки ті бактеріальні клітини, які прийняли ДНК і мають плазміди здатні рости на селективному середовищі.