130. Культивирование вирусов. Культуры клеток: виды, методы заражения. Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток. Типы цпд. Вирусные включения: природа, локализация, значение.

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).

Первичные (неперевиваемые) культуры кл.— это кл. какой-либо ткани, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в спец. питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. Их получают из ткани после механич. измельчения, обработки протеолитическими ф-тами и стандартизации кол-ва кл.

Полуперевиваемые (диплоидные)— кл.одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона ч-ка используются для диагностики вирусных инф. и при пр-стве вирусных вакцин.

Перевиваемые кл.линии х-ся бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные кл.культуры (СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи), отдельные кл. которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в кл. таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Др. источник перевиваемых кл. линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация кл. происходит in vivo. Применяются следующие линии перевиваемых кл.: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки..

Трансфецированные культуры кл. Разработаны экспериментальные линии культур кл. методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных АГ. Такие культуры кл. экспрессируют поверхностный б.опред. вируса (HBs-антиген, gp120) на мембране. Такие культуры используются для изучения иммунологических мех-мов патогенеза вирусных инф., разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред – наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бычей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах – это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

Биологический метод. Заражение.

При выделении вирусов из различных инф. материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые, смывы из органов) применяют культуры кл, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры с хорошо развитым монослоем кл. Перед заражением питат. среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,10,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного а\б для уничтожения бактерий и грибов. После 3060 мин. контакта вируса с монослоем кл.удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

О размножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопатогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток – слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией – округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках – это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы – внутриядерные включения.

Появление бляшек – зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.

131. Культивирование вирусов в курином эмбрионе: методы заражения, индикации и идентификации вирусов. Культивирование вирусов на лабораторных животных: методы заражения, индикации и идентификации вирусов.

Выделение вирусов в куриных эмбрионах

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7 12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования. Живые эмбрионы проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры. Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения могут быть различны: нанесение материала на хорион-аллантоисную оболочку, введение в амниотическую и аллантоисную полости или в желточный мешок. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной РГА на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию «бляшек» на хорион-аллантоисной оболочке.

Выделение вирусов на лабораторных животных

Лабораторные животные используются для выделения вирусов из инф. материала, когда невозможно применить культуры кл. или куриные эмбрионы. Используют преимущественно новорожденных белых мышей, сирийских хомяков. Заражают животных в соответствии с цитотропизмом вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на проявлении у животных признаков инфекционного заболевания, их гибели, характере патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглютинации.