Визначення концентрації холестеролу у сироватці крові ферментативно за набором реактивів

Завдання. Визначити концентрацію холестеролу у сироватці крові.

Принцип. Внаслідок гідролізу ефірів холестеролу холестеролесте-разою утворюється вільний холестерол. Холестерол, який утворився внаслідок гідролізу та той, що є в крові окиснюється киснем повітря за участі холестеролоксидази з утворенням еквімолярних кількостей гідроген пероксиду. За участі пероксидази гідроген пероксиду окиснює хромогенні субстрати з утворенням забарвленої сполуки, інтенсивність якої прямо пропорційна концентрації холестеролу у крові та визначають фотометрично при довжини хвилі 540 нм.

Хід роботи. У штатив помістити 3 хімічні пробірки, позначити – проба, калібрувальна, холоста. Відміряти по 0,01 мл сироватки крові у пробу; 0,01 мл калібрувального розчину у калібрувальну; 0,01 мл дистильованої води у холосту. Відміряти 1 мл розчину реагенту і додати відповідно у пробу, калібрувальну і холосту. Вміст пробірок перемішати і витримати протягом 10 хвилин при температурі 37°С або протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Виміряти екстинкцію проби та калібрувальної проти холостої при довжині хвилі 540 нм. Розрахувати концентрацію холестеролу у сироватці крові за формулою:

С = Еп/Ек ∙ 5,2, де С – концентрація холестеролу у пробі, ммоль/л; Еп – екстинкція проби; Ек – екстинкція калібрувального; 5,2 – вміст холестеролу у калібрувальному розчині, ммоль/л.

У разі концентрації холестеролу більше 19,4 ммоль/л, пробу необхідно розбавити ізотонічним розчином натрію хлориду і отриманий результат помножити на коефіцієнт розведення.

Клініко-діагностичне значення роботи. Екзогенний холестерол у кількості 0,3-0,5 г за добу надходить з їжею, а ендогенний – синтезується в організмі: 0,8-2 г за добу. Особливо багато синтезується холестеролу в печінці, кишечнику та шкірі. Багата на холестерол нервова тканина, де його міститься 20-30 г/кг. Концентрацію холестеролу визначають у комплексі з іншими тестами для типування гіперліпопро-теїнемії. Концентрація холестеролу в сироватці крові в здорових людей становить у нормі 3,0-5,7 ммоль/л. Тривале підвищення концентрації холестеролу у крові сприяє розвитку атеросклерозу. У патогенезі атеросклерозу провідну роль відіграють ліпопротеїни. Встановлено, що атеросклероз і пов’язані з ним захворювання виникають при значному підвищенні в плазмі крові фракцій ЛПНЩ, а в багатьох випадках і фракцій ЛПДНЩ. Показано, що хіломікрони не можуть проникати всередину судинної стінки через свої великі розміри, а ЛПВЩ і ЛПНЩ і частково ЛПДНЩ цю властивість мають. Однак ЛПВЩ мають серед ліпопротеїнів найменші розміри і легше видаляються із стінок судин через їх лімфатичну систему. Крім того, ЛПВЩ, маючи у своєму складі найбільш високий вміст білків і фосфоліпідів, можуть метаболізуватися в судинній стінці швидше та виводяться з неї легше, ніж багаті на холестерол і тригліцериди ЛПНЩ і ЛПДНЩ. Саме останні, атерогенні ліпопротеїни, здатні проникати в судинну стінку з плазми крові і служити у подальшому первинним субстратом, що викликає атеросклеротичні ураження артерій. Гіперхолестеринемію спостері-гають у хворих гіпертонією, ішемічною хворобою серця, при цукровому діабеті, ожирінні, механічній жовтяниці, нефриті, нефрозі, сифілісі, гіпотиреозіі. Зниження концентрації холестеролу (гіпохолестеринемія) – при туберкульозі, висипному тифі, паренхіматозній жовтяниці, гіпертиреозі, анемії, раковій кахексії, гарячкових станах, деяких порушеннях ЦНС, у разі голодування.