3.1. Способи створення трансгенних тварин
Сучасні технології дозволяють уводити рекомбінантні ДНК до клітин будь-яких типів і досліджувати наслідки експресії в них відповідних генів. Цей процес перенесення генів до клітин вищих організмів також, як і введення бактеріофагів до бактеріальних клітин, називається трансфекцією. Трансфекція еукаріотичних клітин, як правило, має два основні етапи: перенесення ДНК через клітинні мембрани у цитоплазму клітин і подальше її транспортування у ядро. На підставі біологічних наслідків, що супроводжують виникнення клітин-трансфектантів, розрізняють стабільну трансфекцію, коли рекомбінантні ДНК інтегруються в хромосоми клітин-реципієнтів і стають їх невід'ємною частиною, а також тимчасовутрансфекцію (transienttransfection), під час якої молекули рекомбінантної ДНК існують і транскрибуються у ядрах у позахромосомному стані нетривалий час.
Трансгенні технології розроблялися й удосконалювалися на лабораторних мишах. На початку 80-х років до різних ліній мишей було введено сотні генів. Ці дослідження значною мірою сприяли встановленню механізмів генної регуляції й розвитку пухлин, природи імунологічної специфічності, молекулярної генетики росту й розвитку, інших фундаментальних біологічних процесів. Трансгенні миші зіграли свою роль у дослідженні можливості великомасштабного синтезу лікарських речовин, а також у створенні трансгенних ліній, що дозволяють моделювати різні генетичні хвороби людини.
Із розвитком техніки молекулярного клонування. генів число публікацій щодо отримання і дослідження трансгенних мишей стрімко зросло, поступово розширювався спектр проблем і завдань, що вирішувалися за допомогою трансгенозу. Однією з вражаючих робіт на ранніх етапах трансгенозу були експерименти Пальмітера із співробітниками у 1982 р. щодо мікроін'єкції у зиготи мишей гена гормону росту (ГГР) пацюка під контролем сильного промотора металотіонеїнового гена 1 (МТ-1) миші. Перенесення такої штучної конструкції викликало посилений ріст мишей в онтогенезі і значне збільшення ваги трансформованих тварин, що народилися із ін'єкцьованих зигот (рис. ЗО).
Рис. 30. Ліворуч трансгенна миша з геном гормону росту бугая і праворуч контрольна миша
(Газарян К.Г. та ін.,1988)
У середині 80-х років розпочалися експерименти щодо створення трансгенних сільськогосподарських тварин. До цього часу було підібрано оптимальні умови для візуалізації пронуклеусів зигот сільськогосподарських тварин, оскільки більшість зигот містить значну кількість пігментних і жирових гранул, що утруднює процес мікроін'єкції.
У першій із опублікованих робіт стосовно отриманнятрансгенних кролів, свиней і овець використовували як трансген ГГР людини, однак, такого суттєвого прискорення темпів росту тварин, як це було отримано на мишах, не спостерігалося. Поряд із цим, у трансгенних свиней відбулося збільшення ефективності використання їжі і значне зменшення жиру. Хоча необхідно також сказати, що у трансгенних свиней із збільшенням вмісту в крові гормону росту людини спостерігалися відхилення у стані здоров'я.
На початку робіт з трансгенозу було виявлено деякі ускладнення, що пов'язані з технологією. В першу чергу процедура отримання трансгенних тварин поки ще залишається малоефективною. Трансгенні тварини часто менш життєздатні, ніж природні особини. Існують також проблеми із стабільністю експресії трансгена. Все це обумовлює ту ситуацію, що до цього часу трансгенних тварин ще мало використовують у практиці.
Уведення чужорідної ДНК можна здійснити за різними методами (рис. 31):
за допомогою ретровірусних векторів, що інфікують клітини ембріона на ранніх стадіях розвитку, перед імплантацією ембріона в самку-реципієнта;
мікроін'єкцією в збільшене ядро спермія (чоловічий пронуклеус) заплідненої яйцеклітини;
введенням генетично модифікованих ембріональних стовбурових клітин до предімплантованого ембріона на ранніх стадіях розвитку;
за рахунок використання сперміїв, що забезпечують інтродукцію трансгену у геном зиготи в найбільш оптимальний період; різновидом цього способу є використання в якості векторів для перенесення чужорідної чДНК в ембріональні клітини ссавців стовбурові клітини сперматогоній (СКС).