Використання модифікованих ембріональних стовбурних клітин

Уперше лінія ембріональних стовбурних клітин (ЕСК) була отримана із бластоцист миші М. Евансом, М. Кауфманом і Г. Мартіном у 1981 році. Клітини, виділені з ембріонів мишей на стадії бластоцисти, можуть проліферирувати (рости і розмножуватися) у культурі. Ці клітини є поліпотентними (або плюріпотентними), тобто в культурі вони можуть диференціюватися в клітини всіх трьох зародкових листків. У ЕСК не було виявлено ніяких хромосомних аберацій (мутацій) − вони зберігали нормальний генотип соматичних клітин. ЕС-клітини − це клітини-нащадки клітин внутрішньої клітинної маси (ВКМ) бластоцисти, які отримують таким шляхом: бластоцисти культивуються на підкладці з фібробластів, осідають на дно чашки Петрі й розпластуються. Клітини ВКМ декілька разів перевівають, і деякі з їх утворюють початок лінії ембріональних стовбурових клітин.

У 1984 році було показано, що ЕСК, введені в порожнину бластоцисти, дають початок будь-яким органам і тканинам химерних мишей, включаючи й лінію статевих клітин, і успадковуються нащадками химерної тварини. На рис. 35 показані етапи одержання трансгенних мишей за допомогою ЕСК. Серед усіх цих процедур одна із трудомісткіших −підтримка лінії ЕСК . у недиференційованому стані, придатному для створення химерних тварин. У наш час цю технологію найчастіше використовують для одержання трансгенних мишей, тому що донедавна існували тільки лінії ЕСК миші. Однак, за останні кілька років такі клітинні лінії були отримані із бластоцист багатьох інших ссавців. Список цих видівпостійно поповнюється: золотавий хом'ячок (1988), свиня (1990), вівця (1990), корова (1992), кролик (1993), пацюк (1994), норка (1992), мавпа (1995) і навіть людина (1994).

Схема одержання трансгенних тварин вигідна ще й тим, що в цьому разі використовуються не зиготи, як для мікроін'єкцій, а бластоцисти, які легко вимиваються із статевих шляхів самок великих видів ссавців нехірургічним шляхом. Для всіх видів сільськогосподарських тварин розроблено методики тривалого зберігання ембріонів на стадії бластоцисти в рідкому азоті й методи нехірургічної трансплантації їх сурогатним матерям.

Перевагою одержання трансгенних тварин за допомогою ембріональних стовбурних клітин є можливість тестування інтеграції трансгену в культурі клітин. Це означає, що кожний ембріон, що розвився в культурі після пересадження ядер, буде трансгенним і наступна селекція трансгенних ембріонів не потрібна. Крім того, пересадження таких ембріонів реципієнтам приведе до народження тільки трансгенних нащадків. Використання для одержання трансгенних тварин трансформованих ЕСК дає можливість у ряді випадків проводити оцінку експресії трансгенів, що має важливе значення. При мікроін'єкціїтрансгени навмання інтегруються в будь-яку частину генома. Це означає, що вони можуть руйнувати досить істотні гени (інсерційні мутації) або розміщуватися в тих частинах хромосоми, які недоступні для транскрипції. Тестування експресії в культурі уможливить використання для пересадження ядер, а отже й для одержання трансгенних тварин тільки тих клітинних ліній, у яких трансгени є транскрипційно й трансляційно активними.

У 1997 році надійшло повідомлення щодо виведення трансгенних овець за допомогою пересадження ядер стабільно трансформованих первинних фетальних фібробластів. Ступінь трансгенності за використання даного методу становила 100%, у той час як застосування методу мікроін'єкції в тій же лабораторії дозволяло одержати лише 4,35% трансгенних нащадків від числа народжених тварин.

Рис. 35. Схема отримання трансгенних тварин шляхом