Реконструкції ембріонів із використанням ембріональних стовбурових клітин:
1 - отримання культури ЕСК; 2 - уведення у ЕСК генетичної конструкції; 3 - отримання бластоцист для мікроін'єкції: їх отримують від тварин іншої лінії, що відрізняється забарвленням шерсті; 4 - конструювання химерних ембріонів: трансгенні ЕСК уводять у порожнину бластоцисти; 5 - трансплантація химерних ембріонів сурогатної матері; 6 - аналіз тварин, що народилися. Частина з них є химерами, тобто до складу їх організму входять як клітини, що походять із звичайної бластоцисти (на рисунку показані білим кольором), так й клітини-нащадки трансгенних ЕСК (на рисунку - чорні). Для схрещування відбираються тварини, в яких відсоток трансгенних клітин більший; 7 - схрещування химерних самців із самками альбіносної лінії і аналіз їх нащадків для виявлення химерних тварин, які продукують трансгенні гамети; 8 — схрещування мишей покоління тварин F1для отримання нащадків, гомозиготних за введеним геном (за Семенової М.Л., 2001)
Як і за використання ЕСК, даний метод дозволяє проводити аналіз інтеграції в культурі клітин, а також здійснювати цілеспрямоване вбудовування генних конструкцій у бажані ділянки генома. Крім того, використані клітинні лінії можуть бути каріотипізовані в культурі, що дозволить заздалегідь визначати стать трансгенних тварин. Якщо, наприклад, потрібно отримати тварин, що синтезують рекомбінантні білки в молочній залозі, то доцільне народження первинних трансгенних особин жіночої статі, що уможливлює їхнє безпосереднє тестування на наявність експресії. Після одержання трансгенних тварин з різних клітинних ліній і визначення рівня експресії може бути зроблений відбір бажаних клонів для їх подальшого використання у пересадках ядер.
ЕСК відкрили нові можливості для створення тварин як з додатково введеними генами, так і з генами, що виключенні. Виключення у тварини певного гена називають генним нокаутом або генним таргетингом. Нормальний ген в ЕСК замінюється на «зламану» копію, що містить вставку − послідовність, що кодує білок неоміцинтрансферазу. У результаті такої транслокації в клітині відбуваються дві події: по-перше, через вставку зрушується рамка зчитування й білок, що кодується за цим геном, не синтезується, а, по-друге, експресія вставленого гена неоміцинтрансферази робить клітину стійкою до впливу неоміцину. При здійсненні нокауту в культурі ЕСК відсоток клітин із транслокацією дуже низький, але тільки вони виживають у селективному середовищі, що містить антибіотик неоміцин.
У першу чергу технологія таргетингу зробила суттєвий внесок у генетику миші та аналіз різних аспектів функції генів іп vivo. Внаслідок використання таргетингу генів були створені чисельні трансгенні миші із різноманітними цілеспрямованими змінами генів, починаючи від точкових мутацій і закінчуючи хромосомними перебудовами (рис. 36).
Таким чином, генний нокаут, як і перенесення генів, мітохондрій і цілих хромосом, дозволяє не тільки визначати функцію гена, а й модулювати деякі патології людини. У наш час цей прийом стає одним із ключових у молекулярній генетиці. Його надзвичайна важливість на даному етапі досліджень визначається масовим переходом від досліджень щодо структурної генетики до функціональної генетики.
Рис. 36. Схема отримання трансгенних мишей шляхом спрямованої зміни (таргетингу) гена в ЕСК