Метод мікроін'єкції днк

У наш час для створення трансгенних мишей найчастіше використовують метод мікроін'єкцій ДНК. Він потребує таких дій:

1. Збільшення числа яйцеклітин, в які буде ін'єктована чужорідна ДНК шляхом стимуляції гіперовуляції у самок-донорів. Спочатку самкам вводять сироватку жеребної кобили (СЖК), а приблизно через 48 год. - хоріонічнийгонадотропін людини. Внаслідок гіперовуляції утворюється приблизно 35 яйцеклітин замість звичайних 5... 10.

2.Схрещування із самцями самок з гіперовуляцією і їхнє умертвіння. Вимивання з яйцепроводів запліднених яйцеклітин.

3.Мікроін'єкції ДНК у яйцеклітини, що запліднені - як правило, відразу після виділення. Часто трансгенна конструкція, що вводиться, перебуває в лінійній формі й не містить прокаріотичних векторних послідовностей.

У ссавців після проникнення спермія до яйцеклітини ядро спермія (чоловічий пронуклеус) і ядро яйцеклітини існують відокремлено. Після того як останнє закінчує мітотичний поділ і стає жіночим пронуклеусом, може відбутися злиття ядер (каріогамія). Чоловічий пронуклеус, звичайно, набагато більший жіночого, його легко локалізувати за допомогою секційного мікроскопа й увести до нього чужорідну ДНК. При цьому яйцеклітину на час проведення мікроін'єкції можна переміщати, орієнтувати потрібним чином і фіксувати (рис. 33).

Рис. 33. Отримання трансгенних тварин ін'єкційним методом

Після введення ДНК від 25 до 40 яйцеклітин імплантують мікрохірургічним шляхом до сурогатної матері, у якої викликають помилкову вагітність схрещуванням з вазектомованим самцем. У мишей спарювання − це єдиний відомий спосіб підготовки матки до імплантації. Оскільки вазектомований самець сперматозоїдів не продукує, жодна з яйцеклітин сурогатної матері не запліднюється. Ембріони розвиваються тільки з введених яйцеклітин, і мишенята народжуються майже через 3 тижні після імплантації.

Для ідентифікації трансгенних тварин виділяють ДНК із маленького шматочка хвоста й тестують її на наявність трансгена за допомогою блот-гібридизацїі за Саузерном, методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Щоб визначити, чи перебуває трансген клітинахзародковоїлініїтварин, трансгенну мишу схрещують із іншою мишею. Далі можна проводити схрещування нащадків для одержання чистих(гомозиготних) трансгенних ліній.

Жоден з етапів експерименту не ефективний на всі 100%, тому для мікроін'єкцій необхідно використовувати велику кількість запліднених яйцеклітин. Наприклад, за одержання трансгенних мишей після ін'єкції ДНК виживають тільки 66% запліднених яйцеклітин; мишенята розриваються приблизно з 25% імплантованих яйцеклітин, причомутрансгенними з них виявляються лише 25%. Таким чином, із 1000 імплантованих запліднених яйцеклітин розвивається від 30 до 50 трансгенних мишенят. Крім того, введена ДНК може інтегруватися в будь-яке місце в геномі, і найчастіше безліч її копій входять в один сайт. І, нарешті, не всі трансгенні мишенятаматимуть потрібні властивості. В організмі деяких особин транс ген може не експресуватися через невідповідне оточення сайту інтеграції, ав організмі інших число копій чужорідного гена буває занадто великим, що може призвести до гіперпродукції білка й порушення нормальних фізіологічнихпроцесів. Незважаючи на все це,метод мікроін'єкції використовуютьдля одержання ліній мишей, що несуть функціональнітранс гени, досить часто.

Мікроін'єкція чужорідної ДНК в запліднену яйцеклітину − зиготу, розроблена для одержання трансгенних мишей, пізніше стала застосовуватися й для одержання великих тварин − продуцентів лікарських білків людини: кролів, кіз, овець, корів (рис. 34). Перший етап такої роботи − це створення генетичної конструкції із заданими властивостями. Так, якщо дослідник хоче створити трансгенну тварину, в якої чужий ген експресується в клітинах епітелію молочної залози і його продукт виділяється в молоко, то створюється конструкція, що містить рекомбінантну ДНК трансгена й промотор гена-казеїну − білка, що входить до складу молока. В ідеальному випадку ця конструкція повинна працювати лише в клітинах молочної залози й лише під час лактації, не маючи побічного впливу на організм трансгенної тварини.

У наш час, коли методи роботи з ембріонами ссавців досить добре розроблені і великий відсоток ембріонів виживає й нормальнорозвивається після мікроін'єкції, саме генетична конструкція є тим фактором, що визначає, чи буде трансгенна тварина мати бажані властивості. Генна конструкція в складі бактеріального вектора клонується в культурі бактерій Escherichiacoli, виділяється й переводиться в лінеарну форму, що краще вбудовується в геном ембріона, ніж кільцева ДНК.

Рис, 34. Етапи отримання трансгенних тварин методом мікроін'єкцій генних конструкцій у зиготу:

1 - отримання зигот для ін'єкцювання; 2 - введення генної конструкції (мікроін'єкція в пронуклеус); 3 - пересадка ембріонів самкам-реципієнтам (реципієнтами відбирають тварин іншої породи, які відрізняються за кольором вовни та іншими породними ознаками); 4 - тварини, які народжених із ін'єкцьованих ембріонів: лише частина з них містить трансген, як правило, ці тварини є гетерозиготними (трансген міститься лише в одній зиготі) або мозаїками (трансген міститься лише в частині тканин і клітин тварин); 5 - здійснення молекулярно-генетичного аналізу для підтвердження наявності гена, що вводився, у складі генома тварини; 6 - відбір тварин, що продукують трансгенні гамети (схрещування трансгенних тварин із тваринами іншої породи). Селекція трансгенних гомозигот; схрещування трансгенних тварин для отримання гомозиготних та нащадків гомозиготних за введеним геном; 7 - отримання стада трансгенних тварин; 8 - виділення лікарського білка з молока і його очищення (за Семеновою М.Л., 2001)

На наступному етапі роботи генетичну конструкцію ін'єкцюють в одноклітинний ембріон − зиготу. У зиготі генетичний матеріал, отриманий від батька й матері, перебуває у двох пухирцях, оточених

ядерною мембраною, − у чоловічому й жіночому пронуклеусах. Необхідна кількість копій генетичної конструкції вводиться за допомогою мікропіпетки, закріпленої в тримачі мікроманіпулятора. Потім ембріони пересаджують самці-реципієнтові, більшість з них нормально імплантуються й розвиваються до народження. Однак, далеко не всі тварини, що народилися з ін'єцьованих зигот, несуть чужорідний ген. А ті, які все-таки є трансгенними, звичайно, виявляються мозаїчними за введеним геном, тобто несуть його не у всіх тканинах організму. Так що для одержання трансгенних тварин велике значення має молекулярно-генетичний аналіз народженого потомства.

На цьому етапі варто мати відповіді на три питання: перше − чи вмонтувався трансген у геном, друге − чи несуть трансген статеві клітини, третє − чи експресується чужорідний ген? Найкраще, коли отриманий трансгенний самець, статеві клітини якого містять чужорідний ген. У цьому разі трансген буде переданий його нащадкам. Самця можна схрестити з багатьма самками, у тому числі й за допомогою штучного запліднення, і швидко вивести численне потомство (покоління F₁). Тварини F₁будуть нести трансген у всіх клітинах організму, але тільки в одній із двох гомологіичних хромосом, тобто вони будуть гетерозиготні за введеним геном. Для заснування трансгенної лінії треба одержати покоління F₂схрещуючи тварин F₁між собою. Залишається останній етап роботи − аналіз гомозигот з покоління F₂на активність трансгена. На цьому етапі визначають, чи експресується трансген і чи є ця експресія специфічною, тобто йде вона в тих органах і тканинах, де її й передбачалося одержати. Якщо конструкція несла промотор одного з білків молока й передбачалася експресія трансгена в клітинах молочної залози, то потає ще одне запитання: чи виділяється трансгенний білок у молоко? Коли, нарешті, в результаті довгого і складного шляху отримані тварини, що відповідають усім цим вимогам, можна вважати, що роботу зі створення лінії трансгенних тварин завершено. Тепер їх можливо поширювати, схрещуючи між собою − всі їхні нащадки успадковують чужорідний ген.

За використання методу мікроін'єкції ступінь інтеграції, тобто число трансгенних тварин від загальної кількості народжених тварин, коливається в незначних межах залежно від виду тварин. Так, у мишей цей показник у середньому становить 15%, у свиней −10... 15%, у кролів − 10%, у овець, кіз і корів − 5... 10%. Найбільш важливим, з погляду витрат для одержання однієї трансгенної тварини, є показник загальної ефективності трансгенозу, що розраховується як відношення числа отриманих трансгенних тварин до загального числа пересаджених ембріонів, вираженого у відсотках. Величина цього показника також відносно постійна й становить у середньому для мишей − 2%, кролів−1%, овець і кіз − 0,5... 1%, свиней і корів − 0,5%. Слід зазначити, що на частоту інтеграції за використання методу мікроін'єкції впливають такі фактори, як ступінь очищення ін'єкційного розчину, форма й концентрація ДНК, склад буферного розчину для мікроін'єкції, якість ембріонів, а також спосіб пересадження ембріонів реципієнтам (нехірургічний, хірургічний, лапароскопічний).