Лабораторне заняття №5 визначення кількості гемоглобіну за методом салі. Розрахунок кольорового показника крові. Одержання кристалів геміну

Гемоглобін являється найбільш розповсюдженим кров’яним пігментом, до складу якого входять білок глобін та гем. Гем – двовалентне залізо, з’єднане з протопорфіріном. Глобін складається з 4 ланцюгів – доменів (2α- та 2γ - ланцюгів для гемоглобіну F, 2α - та 2β - ланцюгів для гемоглобіну А). Він може легко приєднувати (бути акцептором) кисень за високих концентрацій О₂ у середовищі та легко віддавати (бути донором) при низькому напруженні або тиску О₂.

У нормі рівень гемоглобіну у чоловіків 130-160 г/л, у жінок 115-145 г/л. Починає синтезуватися гемоглобін на стадії базофільних еритробластів, а закінчується - у ретикулоцитах кров’яного русла. Суттєву роль у біосинтезі гемоглобіну відіграють вітамін В₁₂, фолієва кислота, Fe²⁺. У зрілому еритроциті вміст гемоглобіну постійний.

Мета заняття: оволодіти методом кількісного визначення гемоглобіну за Салі, освоїти розрахунок кольорового показника крові і методику одержання кристалів геміну.

Оснащення заняття: щур, штатив, пробірки, предметне та покривне скельця, ракета, склянка, цитрат натрію, йод, мікроскопи, камера Горяєва, бинт, спирт, набір інструментів, гемометр Салі, 0,1 н розчин соляної кислоти, дистильована вода.

Х І Д Р О Б О Т И

Завдання 1. Визначення кількості гемоглобіну за методом Салі

У пробірку гемометра Салі (Рис. 5) налити до першої колової поділки (0,2 мл) 0,1 н розчину соляної кислоти, туди ж додати 0,02 мл крові. Кров необхідно обережно випустити в пробірку на дно під розчин соляної кислоти, промити капіляр верхнім шаром кислоти. Пробірку струснути та залишити на 5 - 10 хвилин. Після цього в пробірку поступово додати дистильовану воду, постійно перемішувати розчин до тих пір, поки колір розчину у робочій пробірці не зрівняється з кольором стандартного розчину. За шкалою, яка є на робочій пробірці, визначити вміст гемоглобіну в абсолютних одиницях та відсотках.

Рис. 5. Гемометр Салі: 1 – пробірки зі стандартним розчином хлориду гематіна, 2 – пробірка для визначення кількості гемоглобіну, 3 – піпетка для крові.

Завдання 2. Розрахунок кольорового показника крові

Кольоровий показник крові розраховують за формулою:

,

або

Кольоровий показник крові у нормі складає 0,8-1

Завдання 3. Добування кристалів гемоглобіну

1. До 1 мл крові додайте дистильованої води та спирту в кількості ¼ частини всієї рідини і поставте на холод, де почнуть кристалізуватися кристали гемоголобіну (Рис. 6 А).

2. У краплину канадського бальзаму, розчиненного хлороформом, додате краплину свіжої крові, розмішайте, накрийте покривним скельцем. Розглянте під мікроскопом початок і подальшу кристалізацію гемоглобіну.

А Б

Рис. 6. А - Кристали гемоглобіну: 1 - людини, 2 – кішки, 3 – морської свинки, 4 – хом´яка, 5 – білки, 6 – протея, 7 – лебедя, 8 – кенгуру, 10 – лисиці, 11 – лані. Б – кристали геміну людини

Завдання 4. Одержання кристалів геміну

На предметне скло нанести краплю свіжої крові, посипати кухонною сіллю (дрібно розтовченої) та додати 2-3 краплі льодяної оцтової кислоти. Утворений розчин накрити покривним скельцем і підігріти на полум’ї спиртівки, не доводячи до кипіння. Після охолодження предметне скло розмістити під мікроскопом і під великим збільшенням розглянути кристали геміну, що утворилися. Гемін – це речовина, що утворюється шляхом денатурації гемоглобіну у кислому середовищі. При цьому гем відокремлюється від білку і утворює комплекс з негативним іоном кислоти. Гемін легко кристалізується у формі ромбоподібних пластинок (Рис. 6 Б). Одержання кристалів геміну – якісна реакція на гемоглобін – широко використовується у судовій медицині.

Контрольні питання:

1. Гемоглобін, його будова та функції.

2. Сполуки гемоглобіну.

3. Визначення кількості гемоглобіну за Салі.

4. Обчислення кольорового показника крові, його значення.

Лабораторне заняття №6