Лабораторная работа № 4. Определение азотистых веществ

4.1. Определение общего, небелкового азота, сырого и истинного протеина

4.1.1. Определение общего азота методом Къельдаля на аппарате Selecta Bloc Digest и на установке Pro-Nitro а

Метод заключается в определении азота по Кьельдалю с последующим пересчетом на белок. Сущность метода состоит в разложении органического вещества пробы кипящей концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония, переведении аммония в аммиак, отгонки его в раствор борной кислоты, количественном учете аммиака титрометрическим методом и расчете содержания азота в исследуемом материале.

Реакции протекают по уравнениям:

RCHNH₂COOH + H₂SO₄  CO₂ + SO₂ + H₂O + NH₃;

2NH₃ + H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄ [или NH₃ + H₂SO₄ (NH₄)HSO₄];

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH  2NH₃ + 2H₂O + Na₂SO₄;

3NH₃ + H₃BO₃ (NH₄)₃BO₃;

(NH₄)₃BO₃ + 3 HCl H₃BO₃_Cl

Оборудование и реактивы: весы аналитические класса 2 с пределами измерения от 0 до 200 г; вода дистиллированная; кислота серная концентрированная; натрия гидроксид, раствор 330 г/ дм³ (33 %-ный); медь сернокислая 5-водная; калий сернокислый; индикатор смешанный (Таширо); кислота борная, раствор 10 г/дм³ (1 %-ный); кислота соляная, раствор 0,1 моль/дм³ (0,1 н.), аппарат Selecta Bloc Digest и установка Selecta Pro-Nitro A.

Ход работы: Навеску исследуемого продукта массой от 0,1 до 0,3 г, взвешивают с абсолютной погрешностью не более 0,0005 г в закрытую с одной стороны трубочку из фильтровальной бумаги, помещают в пробирку для сжигания, добавляют несколько кристаллов медного купороса (от 0,2 до 0,3 г), 1 г сульфата калия (или помещают специально приготовленную таблетку смеси катализаторов) и приливают примерно 10 см³ концентрированной серной кислоты плотностью 1840 кг/ м³ (серную кислоту приливать очень осторожно, не допуская попадания на стол, одежду, кожу).

Пробирки с пробами (в т.ч. и по п. 2.1.2) помещают в аппарат Selecta Bloc Digest для минерализации, закрывают его и подключают к водоструйному насосу. Рекомендуемый режим минерализации:

10 минут при температуре 125 °С

20 минут при температуре 220 °С

30 минут при температуре 380 °С

По окончании минерализации пробирки выдерживают до снижения температуры примерно до 100-150 градусов, разбирают установку. После охлаждения пробирок к их содержимому добавляют дистиллиро­ванную воду, не допуская образование осадка. Если осадок всё-таки образовался, то его необходимо растворить в дистиллированной воде.

Перед проведением отгонок необходимо:

2. Заполнить все бутыли в аппарате ProNitro реактивами, указанными на этикетке.

3. Открыть кран подачи воды; удостовериться, что все сливные шланги направлены в канализацию.

4. Залить в резервуар дистиллиро­ванную воду.

5. Включить установку ProNitro; дождаться появления меню.

6. Вставить пустую пробирку в установку.

7. Выбрать меню «TEST», пункт «DEST», запустив тем самым холостой цикл дистилляции. Проводить его до тех пор, пока процесс дистилляции не начнёт проходить стабильно: в пробирку будет подаваться пар, а уровень жидкости в приёмнике будет повышаться.

8. Выйти из меню «TEST» и войти в меню анализа.

9. Рекомендуется провести пробную отгонку до анализа рабочих опытов. Поскольку пустая пробирка уже установлена, достаточно запустить цикл анализа. В целях экономии реактивов следует выставить объём NaOH минимальным (1 — 5 мл). Нулевой объём, тем не менее, устанавливать нежелательно.

10. Если во время запуска контрольного анализа появляется сообщение «HIGH SIGNAL LEVEL», следует нажать копку ESC, а потом START, перезапустив тем самым анализ. Это позволит промыть приёмник. Если и при этом будет та же ошибка, то следует проверить качество борной кислоты с индикатором. Если она имеет бирюзовый цвет, то, вероятно, за счёт примесей и загрязнений, туда попали основания. Решить проблему можно путём добавления нескольких капель серной или соляной кислоты 0,1 н., в результате чего окраска будет сине-фиолетовой. Если добавить слишком много сильной кислоты, то окраска станет интенсивно фиолетовой, а прибор будет давать сообщение «LOW SIGNAL LEVEL». Если количество добавленной кислоты минимально, то можно продолжить анализ, нажав кнопку ENTER, но возможна систематическая ошибка (результат окажется заниженным), поэтому к борной кислоте следует добавить несколько капель 0,1 н. NaOH.

11. После проведения контрольного анализа результат должен быть минимальным (объём соляной кислоты должен составлять менее 0,1 см³). Если результат будет существенно выше, то следует повторить контрольный опыт. Причиной может оказаться загрязнение установки во время предыдущих отгонок, особенно при определении азота летучих оснований.

12. Аккуратно извлечь пробирку (её температура — около 100 °С) и слить её содержимое. Установить пробирку с минерализованной пробой, удостовериться в герметичности и плотно закрыть дверцу установки.

13. Удостовериться в достаточном количестве реактивов в бутылях.

14. Проверить объём NaOH в меню анализа. Рекомендуемый объём — 80 — 95 см³, в зависимости от количества внесённой концентрированной серной кислоты. Объём борной кислоты можно установить на уровне 50 см³.

15. Запустить анализ. После полного внесения щёлочи в пробирке цвет смеси должен быть либо грязно-болотного, либо интенсивно-синего, либо фиолетового цвета. Если раствор будет оставаться бесцветным или бледно-голубым, то это означает, что не вся серная кислота была нейтрализована. В результате отгонки, вероятнее всего, будет получен нулевой результат. Такая ситуация не должна быть допущена.

16. Снять результаты анализа: либо объём HCl, либо массу азота в мг.

17. Перейти к п. 11 и, при наличии оставшихся проб, провести их анализ

Массовую долю общего азота рассчитывают по одной из следующих формул:

- при использовании объёма соляной кислоты V, см³

- при использовании массы азота m_N, мг

,

где m — масса навески, г;

K — поправка к титру 0,1 н раствора HCl.