Послідовність лабораторної діагностики

М атеріал від хворого

Мікроскопія №1 Вирощування накопичувальної культури збудника

Чиста культура

Мікроскопія №2

П еревірка фізіології збудника Біопроба на лабораторних тваринах

Імунологічні дослідження

Мікроскопія №3

Правила відбору і пакування патологічного матеріалу

Матеріалом для дослідження можуть бути проби: від хворих або мертвих тварин; зразки об’єктів оточуючого середовища (повітря, вода, грунт, корми, харчові продукти тощо). Матеріали для дослідження будь-якої консистенції (тверді, рідкі, напіврідкі) повинні бути відібрані в стерильну тару (рис.2). Тара має етикетку, на якій вказують: дату відбору зразка; вид матеріалу; вид тварини; прізвище і адресу господаря.

З твердим посмертним патологічним матеріалом ветеринарний лікар має справу при загибелі тварини (шматки органів – легені, трахея, печінка, селезінка, лімфатичні вузли тощо). Також твердим, але прижиттєвим матеріалом можуть бути шматочки ураженої шкіри та волосся. Рідкі та напіврідкі матеріали є прижиттєвими (гній, фекалії, ексудат, кров, молоко, слина, сеча, змиви з ротової порожнини, носоглотки , статевих органів).

К онсистенція проби
Рідка	Напіврідка	Тверда
Скляні банки і флакони, закриті під час стерилізації ватно-марлевими пробками. До них прив’язують стерильну гумову пробку, загорнуту в папір. Можна використовувати герметично закриті скляні банки або флакони, пробки яких придатні до автоклавування.		Широкогорлі скляні банки. Вони можуть бути закриті або герметичними пробками, придатними до автоклавування, або стерильними фольгою чи папером, що прикриті продезинфікованою кришкою.

Місце відбору зразка визначається: біологічними особливостями збудника; тропізмом збудника хвороби при розмноженні в макроорганізмі.

Виготовлення поживних середовищ. Стерилізація середовищ та лабораторного обладнання

Дослідження збудника хвороби неможливе без накопичення його біомаси у вигляді:

• колонії на твердому поживному середовищі;

• завісі, плівки або осаду – в рідкому;

• вогнища запалення – в конкретному органі або органах організму лабораторної тварини, до яких збудник має максимальну пристосованість (тропність).

В перших двох випадках для культивування мікроорганізмів потрібно мати стерильні живильні середовища певного складу та консистенції. Такі середовища можна розділяти за різними ознаками. Найчастіше використовують поділ за складом; за консистенцією; за призначенням для виділення певної кількості видів мікробів (табл.8).

Табл.8. Характеристика живильних середовищ.

№ п/п	Ознака	Тип	Характеристика середовища
1	Склад	Природне	Складається з продуктів рослинного або тваринного походження і має невизначений хімічний склад.
		Напів-синтетичне	Складається з продуктів рослинного або тваринного походження та хімічних речовин в певній кількості. Хімічний склад визначено тільки частково.
		Штучне	Складаються тільки з певної кількості хімічно чистих речовин, що розводяться в дистильованій воді.
2	Консис-тенція	Рідке	Компоненти середовищ розчиняються у водопровідній або дистильованій воді.
		Напіврідке	До рідкого середовища додаються загусники: 0,1-0,2% агар-агару* або 5-7% желатину*.
		Тверде	До рідкого середовища додаються загусники: 1,5-2,5% агар-агару* або 10-15% желатину*.
3	Призначення	Загальне	Середовище, на якому ростуть мікроби багатьох видів з одної або різних морфологічних груп .
		Спеціальне	Наявність певних речовин в середовищі призводить до появи специфічних ознак у колоній мікроорганізмів (зміни в середовищі навкруги колонії). Такими речовинами є кро, крохмаль, твін, холестерин яєчних жовтків тощо.
		Диференційно-діагностичне	До складу середовища обов’язково входять барвники. В результаті у певних виді мікробів утворюються кольорові колонії або середовище навкруги колонії змінює забарвлення.
		Елективне	Наявність певних речовин в середовищі дозволяє рости на ньому представникам тільки одного роду.

Всі живильні середовища повинні відповідати таким вимогам:

• мати достатню кількість води та необхідних елементів живлення;

• бути вільним від будь-яких мікроорганізмів (стерильним);

• бути прозорим (для спостереження за ростом мікроорганізмів);

• мати відповідний рівень кислотності. рН середовищ змінюється в залежності від біологічних властивостей досліджуваних мікроорганізмів і коливається в межах 5,0 – 8,5.

Найкращим загусником для поживних середовищ є агар-агар – поліцукор, який виділяють з морських водоростей. Дана речовина розплавляється при температурах вищих 45^о С. Після охолодження середовища полімерна структура відновлюється і середовище загусає. Споживати агар-агар, тобто – розривати зв’язки в полімерних ланцюгах здатні тільки окремі види океанських мікроорганізмів. Патогенні і сапрофітні гетеротрофні мікроби, які співіснують з організмом тварин, не мають ферментів для його розщеплення. Тому тверде середовище і після висіву на нього таких мікроорганізмів, і після їх тривалого культивування не змінює густини. Агарові середовища розливають в чашки Петрі та пробірки ( „скошений агар”). Вони використовуються при первинному виділенні мікроорганізмів із патологічного матеріалу та при вирощуванні чистої культури збудника.

На відміну від агар-агару желатина – продукт, який отримують при виварці кісток, складається з амінокислот та поліпептидів рідної довжини. Ці речовини здатні вживати різні види гетеротрофних мікробів. Тому в процесі росту багатьох з них желатина розріджується. Середовища з даним загусником розливають тільки в пробірки і використовують при проведенні біохімічних досліджень.

На будь-який біологічний об’єкт (і мікробні клітини в тому числі) діють фактори середовища, які можна поділити на декілька груп. Оптимальними умовами для розвитку мікроба певного виду є такі:

• достатня кількість необхідних поживних речовин,

• відповідний температурний інтервал,

• необхідна кількість кисню;

• певна вологість субстрату, на якому розвивається мікроорганізм;

• рівень опромінення мікробів на середовищі існування не заважає їх росту та розмноженню;

• відсутність токсичних для мікроорганізму речовин.

Фактори середовища

Ф ізичні Хімічні Біологічні

Температура Кислоти, луги Антибіотики

випромінювання солі важких Ме фаги

магнітне поле, миючі засоби

електрострум органічні розчинники

Один з перелічених факторів або їх сукупність можуть сформувати в середовищі існування мікроорганізмів такі умови, при яких їх розвиток почне уповільнюватись (мікробостатичний ефект) або взагалі припиниться (мікробоцидний ефект).

Остаточне знищення мікроорганізмів (і спорових, і неспорових) на лабораторному обладнанні та в поживних середовищах найчастіше проводиться за допомогою високої температури. Методами, які дозволяють простерилізувати обладнання є:

• тиндалізація. Дробна стерилізація при температурі 95-100^оС. Нагрівання проводиться впродовж 10-20 хв., після чого настає перерва на 10-12 год. Цикл повторюють 3-4 рази. Таким методом стерилізують як поживні середовища, так і лабораторний посуд та інше обладнання.

• автоклавування. Стерилізація при температурі 108-140^оС в спеціальному приладі (автоклаві). Нагрівання проводиться при підвищеному тиску, що збільшує температуру кипіння води. Температура (значення надлишкового тиску) та час стерилізації (від 10 хв. до 2 год.) залежить від виду матеріалу, його відношення до високих температур та ступеню обсіменіння мікроорганізмами. Метод дозволяє отримати стерильні середовища, лабораторний посуд та інше обладнання.

• стерилізація сухим жаром. Стерилізація при температурі 160-180^оС в сушильній шафі. Метод обробки порожнього скляного посуду. Тривалість стерилізації залежить від температури і складає від 2 год. при мінімальній температури до 30 хв. при максимальній.

• фламбірування. Стерилізація металевих предметів в полум’ї при температурі 300-400^оС.

Додатковими методами, які дозволяють зробити стерильними певні види середовищ та обладнання є газова стерилізація при використанні окису етилену, фільтрування рідин та газів крізь дрібнопористі скляні та керамічні фільтри, тканини або полімерні нітро- та ацетат целюлозні мембрани, опромінення обладнання γ- та β-променями на спеціальних установках.