3. Методы анализа некоторых ядовитих веществ.

Вопросы для самостоятельной подготовки:

1. Биологические методы.

2. Биохимические методы.

3. Физико-химические методы.

Способы идентификации токсических веществ

1. Биологические методы

Биологические методы основаны на различной чувствительности биологических тест-объектов к ядам. При использовании биологического метода существенное значение имеет выбор тест - объекта и способа введения исследуемых веществ.

Биопроба на животных. Как правило, токсикологические исследования проводят на наиболее чувствительных видах животных. Обычно для этих целей используют белых мышей, кошек, крыс, кроликов, собак. Мыши, например, примерно в 10 раз чувствительнее к зарину, чем собаки, кошки весьма чувствительны к ФОС. При определении подходящих видов животных для биопробы учитывается их масса, количество имеющегося патологического материала и другие факторы.

Способы определения наличия токсических веществ в корме путём биопробы на животных:

- скармливание исследуемого продукта животным;

- введение экстракта, полученного из патологического материала или образцов корма, через зонд в желудок;

- парентеральное введение животным экстрактов из исследуемых продуктов;

- нанесение экстракта на кожу животным.

Для биопробы подбирают только клинически здоровых животных. В процессе опыта проводятся клинические наблюдения, а при необходимости - биохимические, физиологические и морфологические исследования.

Результаты биопробы определяются по изменению соответствующих показателей клинического статуса животных, физиологических или биохимических показателей.

Алиментарная проба на животных.

К некоторым видам токсических веществ проявляют повышенную чувствительность многие виды лабораторных и сельскохозяйственных животных. Однако, на практике для биопробы используют животных с небольшой массой тела: белые мыши, морские свинки, кролики, кошки, цыплята, голуби, утята. Алиментарная проба используется, например, для определения токсических веществ, вырабатываемых микроскопическими грибами.

При постановке биопробы подозрительный корм скармливают животным на протяжении нескольких дней (до 10 суток). Одновременно с подопытной группой, в обязательном порядке, содержат контрольную группу животных, которым скармливают доброкачественныйкорм. Скармливание токсического корма вызывает гибель животных с клиническими признаками, характерными для той или иной группы яда. Показателями токсичности испытуемого корма, кроме гибели животных, считается: потеря массы тела, расстройство функции желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы; у птиц - цианоз гребня и серёжек, анемия. Резко токсичные образцы корма могут вызвать гибель животных без характерныхклинических симптомов интоксикации.

Токсичность жмыхов, шротов, кормов животного происхождения определяют путём введения в желудок белым мышам (цыплятам и др. животным) водных взвесей и вытяжек из соответствующих кормов. Сухой остаток, после удаления органического растворителя, растворяют в воде или другом инертном растворителе (часто подсолнечное масло). Максимальное количество взвеси, вводимой белым крысам - 0,5, иногда - 2,0 мл. Взвесь вводят через специальный зонд. Этим способом можно определять токсичность и других кормов, а также извлечений из них. Токсичность корма также определяет по времени гибели подопытных животных, степени проявления клинических симптомов интоксикации. При оценке результата обязательно учитывают объём (массу) взятого на анализ образца корма и относительное количество вытяжки, введенное подопытному животному.

Наиболее распространённым является следующий способ постановки биопробы на белых мышах. Навеску измельчённой пробы корма массой 200 г помещают в колбу с притёртой пробкой и заливают 400 мл ацетона. Экстракцию токсических компонентов проводят в аппарате для встряхивания в течение 2 часов или при периодическом перемешивании в течение 20 часов. Экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр. Остаток корма в колбе промывают 100 мл ацетона, который отфильтровывают и объединяют с первичным экстрактом. Растворитель удаляют в вакуумном ротационном испарителе или на водяной бане при температуре 45-50°С до объёма 40-50 мл. К экстракту добавляют 4 мл подсолнечного масла и продолжают упаривать ацетон до удаления запаха растворителя (ацетона).

Для опыта берут 5 белых мышей массой по 18 - 20 г и выдерживают их без корма 4-5 часов. После этого, с помощью шприца-зонда, в желудок каждой мыши вводят по 0,5 мл масляного раствора экстракта. За мышами ведут наблюдение в течение 5 суток с момента введения экстракта. В период опыта мышей содержат на обычном рационе. Одновременно с этим, 5 контрольным мышам вводят чистое подсолнечное масло. За мышами ведут ежедневное клиническое наблюдение, определяют их массу тела.

В конце опыта, если через 5 суток не было гибели животных, их усыпляют эфиром. Вскрывают как павших животных (в день гибели), так и убитых.

Определяют 3 степени токсичности корма:

1. Корм не токсичный: все мыши живы, клинических признаков токсикоза не наблюдается, на вскрытии убитых мышей патологоанатомических изменений не обнаруживается.

2. Корм слаботоксичный: все мыши живы. Наблюдаются клинические признаки токсикоза: расстройство желудочно-кишечного тракта (понос или запор), нарушение функции центральной нервной системы (угнетение, малоподвижность, возбуждение, дрожь, нарушение координации движений). На вскрытии - геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта.

3. Корм токсичный: Наблюдается гибель мышей, потеря живой массы, расстройство функции желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы. На вскрытии обнаруживается геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта, дистрофические изменения печени, почек, кровоизлияния в паренхиматозных органах.

Данный метод даёт возможность сделать общее заключение о токсичности той или иной партии корма, однако это не исключает необходимости проведения дальнейших исследований с целью качественной и количественной идентификации токсического начала.

Кожная проба на кролике.

Этот способ используется для определения токсичности зернофуража, комбикормов и других продуктов. В течение длительного периода времени кожная проба относилась к стандартным методам определения токсичности кормов. Для выполнения этой пробы отбирают обычно 50 г корма и экстрагируют его органическим растворителем. Органический растворитель отделяют в выпаривательную чашку и удаляют до получения сухого остатка. Сухой остаток растворяют в нескольких каплях подсолнечного масла или рыбьего жира.

В качестве подопытных животных используют кроликов с массой тела до 2,5 - 3,0 кг и непигментированной кожей. За несколько часов до постановки биопробы у кроликов выстригают на боках участки шерсти (3 на 6 см). На оголенную неповреждённую поверхность кожи кролика наносят полученный экстракт и слегка втирают его стеклянной палочкой. Экстракт наносят дважды с интервалом 24 часа. Для предотвращения слизывания экстракта на шею кролика надевают предохранительный воротник (кожа, резина, фанера). Реакцию учитывают ежедневно. При нанесении токсического вещества воспалительный процесс начинает развиваться уже на вторые сутки и усиливаться на 4-5 сутки. Эти сроки могут изменяться в зависимости от дерматотоксических свойств ядовитого вещества и некоторых других моментов. При учёте реакции на коже кролика определяют глубину и характер поражения кожи.

Различают четыре степени интенсивности воспалительной реакции:

1. Первая - покраснение, повышенная чувствительность кожи, шелушение. Симптомы исчезают через 1-2 дня после нанесения экстракта. Корм слабо токсичный.

2. Вторая - покраснение, болезненность, незначительное утолщение кожи, мелкие, одиночные желтоватые пузырьки. Затем на их месте возникают корочки подсохшего экссудата, шелушение. Корм слабо токсичный.

3. Третья - покраснение, сильное утолщение, болезненность, складчатость кожи, на всей поверхности возникают темноватые пузырьки. Затем - некроз, иногда язвы, сплошной тонкий струп. Токсичный корм.

4. Четвёртая - покраснение, сильный отёк, выступающий в виде массивного вала на нижней границе очага, глубокий сухой некроз, образование долго незаживающих язв, толстый и сплошной струп. Корм резко токсичный.

Глазная проба.

Измельчённый корм заливают водой (1:10), экстрагируют до 24 часов, а затем отделяют жидкую часть. Контролем служит аналогичный фильтрат. Подопытному животному вводят в конъюнктивальный мешок одного глаза по 5 капель экстракта, с интервалом 5 минут, в течение часа. Во второй глаз вводят контрольный экстракт. Через 1 час отмечают состояние зрачка. Зрачок может быть расширен или сужен, в зависимости от характера действующего начала. Так, например, при наличии токсинов гриба из рода Fusarium зрачок расширяется на 3-4 мм. Расширение зрачка сохраняется в течение 5-6 часов. Особо токсичные экстракты могут вызывать поражение роговицы и конъюнктивы.

Проба на бородках кур.

При постановке этой пробы корм экстрагируют органическим растворителем. Затем органический растворитель отгоняют. Остаток растворяют в масле и вводят 0,1 мл его в одну из бородок кур. В другую бородку вводят экстракт из доброкачественного корма. Реакцию оценивают по степени развития воспалительного процесса, отёка, кровоизлияний и некроза на месте введения.

Проба на белых мышах с парентеральным введением.

Для постановки этой биопробы также используют сконцентрированный экстракт корма. Сухой остаток растворяют в стерильном растительном масле и 0,5 мл его вводят подкожно белым мышам. При введении экстракта от резко токсичного корма мыши погибают через 6-12 часов. Общий срок наблюдений до 3 суток. Слабо токсичный корм вызывает развитие некроза на месте введения экстракта. В данном случае также обязательное использование контроля с экстрактом из доброкачественного корма.

Определение токсичности на простейших.

В практике используется несколько вариантов этого способа. В общих чертах этот способ сводится к извлечению токсических компонентов кормов (или другого субстрата) каким-либо растворителем, удалению органического растворителя и переводу остатка в водную среду. В качестве тест-объектовиспользуют чистую культуру простейших, которую выращивают, подкармливая сенным настоем, который содержит клетки бактерий. Для определения токсических свойств экстракта несколько капель его смешивают с культурой простейших. Критерием токсичности служит время гибели простейших от воздействия испытуемого экстракта. При воздействии на простейших резко токсичного экстракта они погибают через 3 -5 минут, токсичного - 8-20 минут, слабо токсичного - через 2 часа. Нетоксичные экстракты позволяют жить простейшим в течение 24 часов и более. Недостатком этого метода является высокая чувствительность простейших к внешним условиям и другим факторам среды обитания.

Определение токсичности на чувствительных микроорганизмах.

Для определения токсичности этим способом необходимо иметь специфические тест-культуры микроорганизмов и системы их культивирования. Недостаток этого способа заключается в том, что каждый токсин требует тестирования своей специфической тест-культурой.

Наиболее часто этот способ используется для тестирования продуктов на микотоксины и антибиотики. Наличие токсического вещества при использовании этого метода определяется по степени задержки роста тест-культуры или образованию зон задержки роста (на плотных питательных средах).

Для реализации тестирования этим способом используют суточные тест-культуры. Несколько капель этой тест-культуры наносят на поверхность агара в чашке Петри и равномерно распределяют по его поверхности (образование газонного роста). Затем растворы исследуемого токсина наносят на бумажные диски или вносят в цилиндрики, расставленные на агаре. Чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста тест-культуры, в течение 24 часов. При наличии в образце токсина вокруг диска (или лунки) образуется зона задержки роста тест-микроба.

Метод серийных разведений также может быть использован для количественного определения токсина (антибиотиков и др.) в испытуемом объекте.

Определение токсичности на рыбах.

Наиболее известен метод определения токсичности зернофуража на рыбах гуппи. Для определения токсических свойств корма его экстрагируют органическим растворителем. Органический экстракт отделяют, фильтруют, а затем упаривают до получения сухого или маслянистого остатка. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и переносят его в сосуд с 500 мл воды из аквариума, в который и помещают 5 рыб гуппи. Наблюдение ведут в течение 24 часов. В качестве контроля используют 1% раствор ацетона, в котором рыбы гуппи остаются живыми в течение 3 суток.

Определение токсичности на эмбрионах птиц.

Куриные эмбрионы, как биологический тест - объект, получили довольно широкое распространение при изучении токсических свойств афлатоксинов и некоторых других токсических веществ. При введении афлатоксина в желток используют 5 дневные эмбрионы, в воздушную пугу - 1 дневные, в хорионалантоисную - 9 дневные. Экстракт обычно концентрируют и растворяют в пропиленгликоле, который не токсичен для куриных эмбрионов. В желток вводят до 0,5 мл экстракта, в воздушную пугу - до 0,04 мл экстракта. Место введения заклеивается и эмбрионы инкубируют в термостате. Токсичные экстракты задерживают рост и развитие эмбриона на 5-10 сутки. Иногда зародыш погибает. При вскрытии отмечают отёчность, кровоизлияния, дистрофические изменения печени, недоразвитие конечностей и другие аномалии развития эмбриона. При введении экстрактов в хорионалантоисную оболочку зародыш погибает иногда через несколько часов. Однако,наблюдение за эмбрионами ведут в течение 21 суток. Токсическое действие экстрактов определяют также по состоянию эмбриона, изменениях в хорионалантоисной оболочке. Основные патологоанатомические изменения обнаруживаются также в печени, почках и сердце эмбриона.

Определение токсичности на культуре клеток.

Используют первичные и перевиваемые культуры клеток.