Практична частина Завдання №1. Визначення перекисного гемолізу еритроцитів
Практичне значення роботи: перекисний гемоліз еритроцитів є чутливим показником, який відображає про – і антиоксидантний баланс організму. Експериментальні дослідження свідчать про те, що великі фізичні навантаження викликають значну активацію перекисних процесів, які здійснюють пошкоджуючий вплив і зачіпають різні органи і системи (зокрема, еритроцити, тромбоцити). При великих фізичних навантаженнях відбувається зміна кислотно-лужного стану крові. Сукупність цих факторів змінює стабильність мембрани еритроцита, знижуючи її міцність. А це може призводити до руйнування еритроцитів (гемолізу). Таким чином, зниження рівня антиоксидантів в організмі збільшує аутоокиснення ліпідів мембран еритроцитів, що знижує їх стійкість до гемолізу.
Принцип методу: під час перекисного гемолізу еритроцитів вивільнюється визначена концентрація гемоглобіна, який визначають після осадження еритроцитів в цетрифугаті за допомогою фотоелектроколориметрування.
Матеріали і реактиви: буферний розчин, рН = 7,4; 17% розчин NaCl; робочий реактив рН =7,4 (змішати 50 мл буферного розчину і 50 мл розчину NaCl, потім довести об’єм реактиву до 1 л дистильованою водою). Перед використання робочий реактив струшується для насичення киснем 1-2 хвилини.
Хід роботи:
До 0,1 мл крові додається 7,5 мл робочого реактиву, проба центрифугується 10 хв. при 1500 об/хв при 15 °С. Осад еритроцитів після декантації надосадкової рідини ресуспензується в 7,5 мл робочого реактиву. По 1 мл суспензії еритроцитів розливається в 2 пробірки, які містять по 4 мл робочого розчину і в пробірку, яка містить 4 мл дистильованої води (холоста проба на 100% гемоліз). Всі проби інкубуються при 37 °С протягом 4 годин, після чого збовтуються і центрифугуються (10 хв., 1500 об/хв.).
Оптична щільність надосадкової рідини вимірюється на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм проти води.
Розрахунок. Величина гемолізу розраховується за формулою:
.
Нормальні величини. Перекисний гемоліз еритроцитів в нормі не перевищує 10—15%.
Завдання №2. Визначення рівня відновленого глутатіону в еритроцитах крові (метод Е. Батлер, О. Дюбон, Б. Келлі, 1963 р.).
Практичне значення роботи: в процесах хімічних реакцій виникають вільні радикали з високою хімічною активністю. Вони викликають окиснення ліпідів, білків, мукополісахаридів і нуклеїнових кислот, порушуючи їх біологічні функції. Захист від вільнорадикального окиснення здійснюють антиоксиданти. Серед антиоксидантів прийнято розрізняти речовини прямої і непрямї дії. Антиоксиданти прямої дії — супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, токофероли, аскорбінова кислота, рутин, біофлавоніди, — безпосередньо елімінують вільні радикали. Антиоксиданти непрямої дії — глутамінова і ліпоєва кислоти, метіонин, холестерин, який міститься в мембранах, і гідрофільні голівки фосфоліпідів — підвищують рівень антиоксидантної активності тканин. Важливим компонентом антиоксидантної системи є відновлений глутатіон, який здійснює як пряму, так і непряму антиоксидантну дію. Його участь в антиоксидантному захисті можна зобразити наступною схемою: цитозольний фермент глутатіонпероксидаза розкладає перекис водню за рахунок одночасного окиснення відновленого глутатіона, який в свою чергу відновлюється глутатіонредуктазою.
Принцип методу: відновлений глутатіон при взаємодії з реактивом Елмана (5,5-дитіобіс-2-нітробензойна кислота) утворює сполуку (2-нітро-6-меркаптобензойну кислоту), забарвлену в жовтий колір, інтенсивність забарвлення якої пропорційна вмісту глутатіону.
Матеріали і реактиви: осаджувальний реактив; 0,3 М розчин Na2HPO4; реактив Елмана; стандартний розчин відновленого глутатіону — 5 ммоль/л (з нього шляхом розведення готують 9 робочих розчинів: 0,1 ммоль/л; 0,5 ммоль/л; 1,0 ммоль/л; 1,5 ммоль/л; 2,0 ммоль/л; і так далі до 8,5 ммоль/л); розчин антикоагулянту.
Хід роботи:
Підготовчий етап:
А). Отримання еритроцитарної маси. У чисту центрифужну пробірку, яка містить 1 мл антикоагулянту, набирають 4 мл венозної крові. Кров повільно стікає в пробірку з голки, введеної в ліктьову вену (у шприц не набирати, щоб уникнути гемолізу еритроцитів).
Набрану кров центрифугують 15 хвилин при 3000— 3500 об/хв. Плазму крові видаляють і додають в пробірку фізіологічний розчин в співвідношенні з еритроцитарною масою 1:3. Ретельно перемішують вміст пробірки і знов центрифугують 15 хвилин при 3000—3500 об/хв. Відбирають прозорий шар фізіологічного розчину, так само промивають еритроцити тричі.
Б). Приготування гемолізату еритроцитів, 1:10. 0,2 мл еритроцитарної маси вносять до 1,8 мл дистильованої води. Перемішати скляною паличкою.
Хід роботи наведений в табл. 18.
Таблиця 18.
Хід підготування дослідної та холостої проб при визначенні
рівня відновленого глутатіона в еритроцитах крові
Інгредієнти |
Дослідна проба, мл |
Холоста проба, мл |
Гемолізат еритроцитів 1:10 Осаджувальний реактив Дистильована вода |
2,0 3,0 - |
- 3,0 2,0 |
Перемішують і витримують 5 хвилин при кімнатній температурі, потім центрифугують 15 хвилин при 3000-3500 об/хв., після чого відфільтровують надосадкову рідину |
||
Центрифугат 0,3 М Na2HPO4 Реактив Елмана |
2,0 8,0 0,1 |
2,0 8,0 0,1 |
Через 5 хвилин колориметрують дослідну пробу проти холостої проби при довжині хвилі 412 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм.
Розрахунок кількості відновленого глутатіону в еритроцитах проводять за калібрувальною кривою. Остання будується шляхом введення в методику замість гемолізату еритроцитів, робочих розчинів відновленого глутатіона: 0,1 ммоль/л; 0,5 ммоль/л; 1,0 ммоль/л; і так далі до 5,0 ммоль/л. На кожне розведення готується три паралелі.
Нормальні величини. Вміст відновленого глутатіона в еритроцитах крові практично здорових людей має чітко виражену вікову залежність (див. табл. 19).
Таблиця 19.
Вікова залежність вмісту відновленого глутатіону
в еритроцитах крові практично здорових людей
Вік, років |
20-44 |
45-59 |
60-74 |
75-90 |
Вміст відновленого глутатіону, ммоль/л |
1,65-2,25 |
1,65-2,95 |
1,93-2,70 |
2,25-2,75 |
Клініко-діагностичне значення дослідження стану оксидантної і антиоксидантної систем організму
Глутатіон – за хімічною структурою – це трипептид, який утворюється в організмі з цистеїну, глутамінової кислоти і гліціну. Він має антиоксидантні і детоксикантні властивості. Найбільше глутатіону знаходиться в печінці (деяка його кількість вивільняється прямо в кровоток), а також в легенях і шлунково-кишковому тракті. Він бере участь у вуглеводному і ліпідному обміні. Дефіцит глутатіону перш за все відображається на нервовій системі, викликаючи порушення координації, розумових процесів, тремор. Кількість глутатіону в організмі зменшується з віком. Як антиоксидант глутатіон руйнує вільні радикали, а в якості детоксиканта сприяє виведенню з організму важких металів і інших токсинів. Дослідження показали, що глутатіон поліпшує мозковий кровообіг і забезпечення мозку киснем.
У плазмі крові у здорових людей не виявляються вільні радикали і показник ООА дорівнює нулю. Але в плазмі крові є певний рівень кінцевих продуктів вільнорадикального окиснення.
При ряді патологічних станів таких як: ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарду, інсульт, гіпертонічна хвороба, атеросклероз, виразкова хвороба шлунку і дванадцятипалої кишки, цироз печінки відмічається високий рівень вільних радикалів в плазмі (ООА), причому простежується тісний кореляційний зв'язок між показником ООА і давністю процесу. Різко збільшується вміст в крові малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів.
Разом з цим знижується загальний рівень антиоксидантної активності (ОАА) плазми і еритроцитів, знижується активність супероксиддисмутази, каталази і відновленого глутатіона в еритроцитах. Зниження зазвичай корелює із ступенем важкості патологічного процесу. Підвищується відсоток гемолізу еритроцитів в тесті перекисного окиснення еритроцитів.
Зробити висновки:
Контрольні питання:
1. Вкажіть відомі Вам енергодаючі засоби.
2. Які існують природні стимулятори і антидепресанти?
3. Які існують природні анаболіки і антикатаболічні засоби?
4. Назвіть БАР-антиоксиданти.
5. Як використовуються багатокомпонентні біологічно активні добавки?
6. Яке значення мають антиоксиданти в організмі спортсменів?
7. Які вітаміни мають антиоксидантні властивості?
Література:
1. Бин А. Фитнесс и питание / Пер. с англ. Е. Богдановой. — М.: Фаир-пресс, 1999. — 416 с.
2. Зотов В.П. Восстановление работоспособности в спорте. — Киев: Здоров'я, 1990. — 197 с.
3. Канышев В.А. Кому что есть? Раздумья о пище. — М.: Физкультура и спорт, 1998. — 224с.
4. Кулиненков О.С., Кулиненков Д.О. Справочник фармакологии спорта. – М.: ТВТ «Дивизион», 2004.
5. Платонов В.Н. Общая теория подготовки спортсменов в олимпийском спорте. – К.: Олимпийская литература, 1997. – 584 с.
6. Скурихин И.М., Нечаев А.П. Все о пище с точки зрения химика. — М.: Высшая школа, 1991. —287с.
7. Таймазов В.А., Марьянович А.Т. Биоэнергетика спорта. – СПб.: Шатон, 2002.