2.2.12. Использование микроорганизмами одноуглеродных соединений

Микроорганизмы способны использовать в качестве источника углерода и энергии одноуглеродные, или С₁-соединения. К таким веществам относятся метан (СН₄), метанол (СН₃ОН), формальдегид (НСОН), формиат (НСООН), метиламин (СН₃NH₂), хлорметан (СH₃Cl), цианид калия (KCN) и др. В большинстве этих соединений углерод представлен в виде метильной группы, поэтому микроорганизмы, использующие их, и получили название метилотрофов.

Метилотрофные микроорганизмы распространены повсеместно, это связано с тем, что практически везде в природе имеются С₁-соединения. Например, ежегодно в атмосферу поступает 10¹⁵ г метана (из болот, прудов, органического ила, промышленных отходов, недр земли, из желудков жвачных животных и др.). Однако в атмосфере он не накапливается, его используют метанокисляющие бактерии. Метан, кроме того, подвергается фотоокислению с образованием метанола. В природе обнаруживаются также формальдегид, формиат, формамид, цианиды и их соли, СО, метиламины, что также определяет места распространения метилотрофов.

Метилотрофные микроорганизмы составляют таксономически неоднородную, не связанную родством группу и включают грамположительные, грамотрицательные бактерии и дрожжи.

По способности использовать С₁ и другие углеродные соединения метилотрофные бактерии делятся на две основные группы: облигатные и факультативные. Облигатные метилотрофы способны расти только на одноуглеродных субстратах. Группа факультативных метилотрофов включает бактерии, которые наряду с одноуглеродными могут использовать и некоторые полиуглеродные соединения.

Облигатные метилотрофные бактерии входят в состав родов: Methylococcus, Methylomonas, Methylosinus, Methylocystis, Methylobacillus, Methylophilus, Methylophaga, Мethylovorus и Methylobacterium. Это в основном грамотрицательные эубактерии с разной морфологией и размерами клеток, подвижные и неподвижные. Облигатные аэробы. Тип метаболизма – дыхательный. Каталазо- и оксидазоположительные. При росте на метаноле имеют сложную систему внутрицитоплазматических мембран двух типов: мембраны первого типа представлены стопками плотно упакованных везикулярных дисков, распределенных во всей цитоплазме; мембраны второго типа имеют вид ламелл, расположенных по периферии клетки. Отличительные признаки родов облигатных метилотрофных бактерий приведены в табл. 5.

Таблица 5. Отличительные признаки облигатных метилотрофных бактерий

Признаки	Роды
	Methylococcus Methylomonas	Methylosinus Methylocystis	Methylovorus Methylobacillus Methylophilus Methylophaga Methylobacterium
Упаковка внутрицитоплазматических мембран	Первый тип	Второй тип	Первый тип
Цикл трикарбоновых кислот	Неполный (не соде-ржат α-кетоглута-ратдегидрогеназы)	Полный	Неполный (не содер- жат α-кетоглутарат- дегидрогеназы)
Покоящиеся формы	Цисты	Экзоспоры	Не имеют
Основной путь ассимиляции С1-сое-динений	Рибулозомонофос-фатный путь	Сериновый путь	Восстановительный пентозофосфатный путь (цикл Кальвина)
Длина углеродной цепи жирных кислот	16 углеродных остатков	18 углеродных остатков	16 углеродных остатков

К факультативным метилотрофам относятся некоторые представители родов Pseudomonas, Arthrobacter, Mycobacterium, Bacillus, Acetobacter, Achromobacter, Nocardia, Hyphomicrobium, Brevibacterium и др. Это различные по морфологии, окраске по Граму, подвижные или неподвижные бактерии, единственным общим признаком которых является способность расти на С₁-соединениях.

Использование метилотрофами С₁-соединений в конструктивном и энергетическим метаболизме привело к формированию у них специфических путей их ассимиляции и окисления.

Процесс полного окисления метана может быть представлен в виде следующей схемы (рис. 38).

Формальдегид у метилотрофных бактерий является ключевым метаболитом, на уровне которого расходятся конструктивные и энергетические пути. Часть формальдегида превращается в вещества клетки по специфическим для метилотрофов ассимиляционным циклическим путям (рибулозомонофосфатному, сериновому и восстановительному пентозофосфатному), большая часть окисляется через формиат до СО₂, что приводит к образованию АТФ.

Рис. 38. Окисление метана и связь энергетического и конструктивного

метаболизма у метилотрофов:

Ф₁ – метанмонооксигеназа; Ф₂ – метанолдегидрогеназа; Ф₃ – формальдегиддегидрогеназа; Ф₄ – формиатдегидрогеназа. Ассимиляционные циклы: 1 – рибулозомонофосфатный,

2 – сериновый, 3 – восстановительный пентозофосфатный

Как уже отмечалось, у метилотрофов функционируют три циклические пути ассимиляции С₁-соединений, ответственных за превращение их в вещества клетки: восстановительный пентозофосфатный, рибулозомонофосфатный и сериновый. Восстановительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина) (см. рис. 48) у метилотрофных бактерий не имеет широкого распространения и обнаружен только у представителей, способных расти автотрофно, а также у использующих формиат. В этом цикле происходит ассимиляция СО₂, полученного при окислении С₁-соединений. В рибулозомонофосфатном (гексулозофосфатном) и сериновом циклах осуществляется непосредственное включение формальдегида, образующегося при окислении разных С₁-соединений. Эти циклические пути ассимиляции формальдегида названы по первому продукту, который синтезируется в них. В рибуломонофосфатном цикле (рис. 39) в результате акцептирования формальдегида молекулой рибулозо-5-фосфата образуется гексулозо-6-фосфат, который затем изомеризуется во фруктозо-6-фосфат. Ферменты гексулозофосфатсинтаза и фосфогексулозоизомераза, катализирующие эти реакции, специфичны для этого цикла ассимиляции С₁-соединений. Далее часть молекул фруктозо-6-фосфата подвергается фосфорилированию с образованием фруктозо-1,6-дифосфата, который альдолаза расщепляет на две молекулы фосфотриозы: фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) и фосфодиоксиацетон.

Рис. 39. Рибулозомонофосфатный цикл ассимиляции формальдегида

метилотрофами:

Ф₁ – гексулозофосфатсинтаза; Ф₂ – фосфогексулозоизомераза; Ф₃ – фосфофруктокиназа; Ф₄ – фруктозодифосфатальдолаза; прерывистой линией обозначены реакции регенерации рибулозо-5-фосфата

Фосфодиоксиацетон используется в реакциях биосинтеза, а фосфоглицериновый альдегид – для регенерации рибулозо-5-фосфата, акцептора формальдегида. Реакции регенерации молекул рибулозо-5-фосфата аналогичны таковым цикла Кальвина (см. рис. 52).

Ключевой реакцией серинового пути фиксации формальдегида является его конденсация с глицином в присутствии тетрагидрофолиевой кислоты, приводящая к образованию серина (рис. 40).

Рис. 40. Сериновый цикл ассимиляции формальдегида метилотрофами:

Ф₁ – серингидроксиметилаза; Ф₂ – трансаминаза, превращающая серин в гидроксипируват и глиоксилат в глицин; Ф₃ – гидроксипируватредуктаза; Ф₄ – глицераткиназа; Ф₅ – фосфоглицераткиназа и енолаза; Ф₆ – ФЕП-карбоксилаза; Ф₇- малатдегидрогеназа; Ф₈ – малил-КоА-синтаза; Ф₉ – малил-КоА-лиаза

Серин далее в реакции трансаминирования превращается в гидроксипируват, последовательное восстановление и фосфорилирование которого приводит к образованию 3-фосфоглицерата. Затем одна часть молекул 3-фосфоглицерата идет на синтез вещества клетки, другая превращается в фосфоенолпируват (ФЕП). Последний карбоксилируется путем включения второй одноуглеродной группы из СО₂ с образованием оксалоацетата. Оксалоацетат восстанавливается до малата, который при участии малил-КоА-синтазы и АТФ превращается в малил-КоА. Малил-КоА расщепляется малил-КоА-лиазой на глиоксилат и молекулу ацетил-КоА – конечный продукт серинового пути, в котором один из углеродных атомов ацетильного остатка происходит из СО₂, а другой из формальдегида. Глиоксилат вступает в реакцию переаминирования с серином, которая обеспечивает регенерацию глицина, и цикл замыкается.

В окислительном метаболизме С₁-соединений у метилотрофов участвуют следующие переносчики дыхательной цепи: флавопротеины, хиноны, цитохромы типа a, b, c, o. Количество энергии, выделяющейся при окислении С₁-соединений соответствующими дегидрогеназами, определяется местом поступления электронов в дыхательную цепь. При окислении метанола в формальдегид метанолдегидрогеназой электроны поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома с. Это приводит к синтезу одной молекулы АТФ. На какие переносчики дыхательной цепи передаются электроны от формальдегида и формиата пока неизвестно.

Метилотрофные бактерии находят широкое практическое применение и являются перспективными объектами биотехнологии. Биомасса метилотрофов характеризуется достаточно высоким содержанием белка и незаменимых аминокислот, например, содержание лизина достигает 5,8 % сухой массы. Перевариваемость бактериальной биомассы составляет 85–98 %, поэтому ее можно использовать в качестве кормовой добавки.

Промышленное значение имеет также биотрансформация метилотрофами органических веществ. Иммобилизованные бактерии, клеточные экстракты или очищенные ферменты окисления С₁-соединений катализируют неспецифическое окисление ряда соединений: ароматических, алициклических и гетероциклических углеводородов, фенолов, спиртов с длинной углеродной цепью. При биотрансформации получают продукты, имеющие потенциальное промышленное значение, например из пропилена пропиленоксид, который является субстратом для синтетических полимеров.

Метилотрофы являются продуцентами аминокислоты серина, витамина В₁₂, убихинонов Q₈, Q₉, Q₁₀, метаксина, поли-β-гидроксибутирата и внеклеточных полисахаридов. Например, выход полисахаридов составляет более 30 % по отношению к массе субстрата. При определенных условиях выращивания до 66 % биомассы метилотрофных бактерий составляет поли-β-гидроксибутират – полимер, имеющий промышленное значение как заменитель пластмасс, но подверженный биодеградации.

Перспективно также использование метилотрофных бактерий в качестве биокатализаторов для обнаружения выбросов метана в угольных шахтах, для очистки сточных вод от метилсодержащих соединений. Наконец, метилотрофы могут служить хорошей основой для создания генно-инженерных штаммов – продуцентов эукариотических белков медицинского и ветеринарного назначения. Показано, что уровень экспрессии некоторых генов (например, интерферонов) в метилотрофных бактериях выше, чем в бактериях E. coli.