7. Иммобилизация в массе носителя.

Относится к физическим методам иммобилизации

В качестве носителей применяются либо полимерный гель, либо полимерное волокно. Носители могут быть природные и синтетические, органические и неорганические.

Для иммобилизации в геле существует два основных способа:

• Объект помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него объектом. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки.

• Объект вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние, например за счет охлаждения..

Для первого варианта используют гели полиакриламида, поли-винилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, альгинатный гель, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

Преимущества:

• Метод относительно прост и универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток.

• Позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя.

• Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу, а также и от других физических факторов.

• Достигается более высокая удельная концентрация иммобилизованных препаратов в носителе. Это в свою очередь теоретически дает возможность поднять продуктивность биотехнологического процесса в целом.

Недостатки:

• Матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще

• Порой иммобилизация проходит в относительно жестких условиях, и иммобилизация приводит к инактивации объекта.

8. Иммобилизация с использованием мембранной технологии и двухфазных реакционных сред.

Суть метода – водный раствор препарата отделяется от водного раствора субстрата избирательно проницаемой мембраной. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Важным фактором является толщина мембраны – с ее уменьшением происходит повышение проявляемой иммобилизованными биокатализаторами активности, что определяется возможностью увеличения диффузии субстрата к биокатализатору.

Наиболее широкое распространение мембранные биокатализаторы получили не в системах биосинтеза, а при создании чувствительных элементов биосенсоров.

В мембранной технологии применяются следующие системы: плоские мембраны, пористые волокна и микрокапсулы.

Плоские мембраны – легко пропускают молекулы субстрата, но представляют собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента или клеток.

Пористые волокна – аналогично случаю плоских мембранных носителей, только здесь используются мембранные полые волокна. Фактически эти волокна представляют собой длинные тонкие трубки, стенки которых выполнены из полимерной мембраны. По сравнению с плоскими мембранами отношение занимаемого препаратами объема к общему объему системы выше, поэтому и выше получаются удельные продуктивности.

Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом.

Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод достаточно универсален, т.е. применим как ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Также удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.

При иммобилизации ферментов с использованием систем двухфазного типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор.