- •1. Определение термина «иммобилизация». Основные требования к носителям и приемам иммобилизации при одно- и многостадийных реакциях.
- •2. Классификация носителей, используемых при иммобилизации. Свойства полисахаридных носителей.
- •Полисахариды.
- •3. Основные требования к материалам-носителям. Выбор носителей при использовании иммоббилизованных препаратов в технологических исследованиях.
- •4. Синтетические полимерные материалы и неорганические носители.
- •5. Характеристика методов физической иммобилизации
- •6. Классификация методов иммобилизации. Иммобилизация на поверхности носителя и силы, определяющие связывание препарата на поверхности носителя
- •7. Иммобилизация в массе носителя.
- •8. Иммобилизация с использованием мембранной технологии и двухфазных реакционных сред.
- •9. Микрокапсулирование
- •10.Иммобилизация металлохелатным способом
- •11 Иммобилизация ферментов
- •13) Влияние иммобилизации на состояние фермента, возможные причины изменения его активности
- •14) Критерии оценки протекания ферментативного процесса при иммобилизации
- •15. Эффекты распределения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами
- •16. Основные показатели стабильности иммобил-ных ферментов, причины, вызывающие изменения стабильности и способы устранения.
- •17. Термостабильность иммобилизованных ферментов и способы ее определения.
- •18. Способы сохранения каталитической активности ферментов при иммобилизации.
- •19. Использование иммобилизованных ферментов в производстве.
- •20. Ферментные электроды: конструирование, стадии функционирования и критерии, определяющие их качество.
- •21.Общая характеристика микробных катализаторов, требования к производственному штамму, преимущества и недостатки иммобилизованных клеток по сравнению со «свободными».
- •22.Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с иммобилизованными ферментами.
- •23. Классификация иммобилизованных микробных биокатализаторов по принципу действия.
- •24. Приемы выбора способа иммобилизации клеток микроорганизмов для промышленных целей.
- •25. Оценка физиологической и метаболической активностей клеток в иммобилизованном состоянии
- •26 Схема биотехнологической переработки растительного сырья. Получение спиртов и кетонов.
- •27. Получение ак, алкеноксидов, витаминов, аб, пав
- •28. Получение органических кислот, углеводов, ферментов
- •29) Утилизация отходов.
- •30) Характеристика реакторов с иммобилизованными клетками.
- •31. Преимущества выращивания растительных клеток в культуре и использование вторичных метаболитов в фармакопии.
- •33. Методы определения жизнеспособности иммобилизированных растит-х клеток.
- •34. Способность иммобилизированных растит-х клеток к биосинтезу. Характеристика процессов биотрансформации (биоконверсия).
- •36. Физиолого-биохимические процессы у иммобилизованных растительных клеток и их отличия от суспендированных (свободных) клеток.
- •37. Приемы выделения и введения в культуру клеток животных.
- •38. Характеристика способов иммобилизации клеток животных и преимущества монослойных культур.
- •1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах)
- •2. Культивирование во вращающихся бутылях (роллерных аппаратах)
- •3. Культивирование в колонках на микроносителях – наиболее оптимальная комбинация выращивания поверхностно зависимых клеток с помощью технологии суспензионных культур.
- •39. Основные параметры, критерии и их характеристика при биотестировании физиологической активности вещества с использованием клеток животных.
- •40. Описание приема биотестирования с использование монослойной культуры клеток животных.
- •41 Процедура проведения анализа содержания гормона с использованием иммоб. Клеток животных
- •Примеры применения иммобилизованных клеток в анализе
- •1. Определение термина «иммобилизация». Основные требования к носителям и приемам иммобилизации при одно- и многостадийных реакциях.
13) Влияние иммобилизации на состояние фермента, возможные причины изменения его активности
При иммобилизации существует опасность, что белок присоединится к носителю в конформации, отличной от нативной. В этом случае каталитическая активность фермента может существенно измениться или вообще исчезнуть.
В реальных условиях в результате иммобилизации пространственная структура фермента может, во-первых, либо существенно изменяться, либо изменяться незначительно; во-вторых, остаться неизменной (что наблюдается чаще всего).
Изменение конформации нативного и иммобилизованного ферментов обусловлено одной из трех причин:
1. Модификацией каких-либо важных для структуры функциональных групп белка, например, связанных с самим процессом иммобилизации фермента (т. е. присоединением к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора, необходимо, например, выбрать соответствующий метод иммобилизации, не затрагивающий этих функциональных групп в белке.
2. Взаимодействием (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между ферментом и носителем, приводящие к денатурации. В этом случае чаще всего достаточно просто заменить носитель.
3. Наличие большого числа связей между ферментом и носителем.
Вторая ситуация, когда в результате иммобилизации конформация фермента не меняется, но нарушается динамика конформационных изменений в белке, а именно замедляются необходимые для катализа конформационные переходы, уменьшается число конформационных стадий и глубина их протекания. В этом случае, как показано, следует проводить иммобилизацию на инертных носителях.
Иногда исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» или как говорят «заморозить» с помощью иммобилизации конформацию фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказывается важным для детекции конформационных изменений в ферментах, индуцированных субстратами, кофакторами и специфическими лигандами.
Как показали многочисленные исследования «замороженные» конформации фермента могут отличаться от обычных, ненапряженных состояний, по целому ряду свойств: стабильности, доступности к действию модифицирующих агентов, сродству к субстрату и специфическим лигандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента иногда рекомендуют проводить в присутствии ферментативной активности.
14) Критерии оценки протекания ферментативного процесса при иммобилизации
Для оценки режима протекания ферментативного процесса чаще всего используют экспериментальные критерии.
1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Как уже отмечалось, в условиях насыщения иммобилизованного фермента субстратом, т. е. при достаточно высоких концентрациях последнего, ферментативный процесс не может контролироваться диффузией субстрата, значит, реакция протекает по кинетическому типу. Однако по мере уменьшения концентрации субстрата повышается вероятность перехода реакционной системы в диффузионную область. В этом случае в координатах Лайнуивера – Берка в зависимости V от S наблюдается выраженный излом: при низких значениях 1/[S] реакция проходит в кинетическом режиме, а при высоких значениях 1/[S] - в диффузионном режиме.
Температурные зависимости. Слабая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом, от температуры может служить указанием на диффузионный режим процесса.
Зависимость скорости реакции от удельной концентрации иммобилизванного фермента. Скорость реакции в диффузионной области не должна изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного фермента. Скорость реакций в этом режиме не должна также зависеть от сдвигов рН среды, ионной силы.
Зависимость скорости реакции от степени измельчения частиц с иммобилизованными ферментами. В кинетической области скорость реакции не должна зависеть от степени измельчения частиц содержащих катализатор (если нет внутридиффузионных ограничений для субстрата). С другой стороны, скорость диффузионноконтролируемых реакций будет возрастать, поскольку уменьшение размера частиц с иммобилизованным ферментом способствует диффузии субстрата к ферменту.
Зависимость от скорости перемешивания. Влияние диффузионных факторов ослабляется по мере ускорения массопереноса при более интенсивном перемешивании. На любой поверхности существует неперемешиваемый слой жидкости. Толщина неперемешиваемого слоя уменьшается при увеличении скорости потока жидкости вокруг частицы. Существенное ускорение перемешивания может перевести реакцию из диффузионной области в кинетическую.
Стерические ограничения. Пространственная сетка матрицы, в которой иммобилизован фермент, может препятствовать передвижению молекул субстрата, например, в силу чисто механических причин. В результате активные центры части ферментативных молекул становятся недоступными для субстрата.