9. Микрокапсулирование

Суть метода в том, что водный раствор с биопрепаратом (фермент, клетка) включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров.

Для формирования микрокапсул с иммобилизованными препаратами существуют два основных подхода: диспергирование и (микро) гранулирование.

В первом случае водная суспензия клеток диспергируется в несмешивающуюся с ней органическую жидкость, а присутствующие в системе специальные добавки образуют на поверхности капелек водной фазы мембранную пленку. Получаемые микрокапсулы имеют неодинаковые размеры – существует некоторое распределение величин их диаметров, зависящее от гидродинамических свойств применяемых жидкостей, интенсивности перемешивания, соотношения объемов фаз, геометрии рабочего сосуда и конструкции мешалки.

Во втором случае водная суспензия препарата через особое дозирующее устройство (гранулятор) инъектируется порциями строго заданного объема в несмешивающуюся с водой органическую жидкость, где на границе раздела фаз поверхности водной капли происходит формирование оболочки микрокапсулы. В этом случае получаются частицы практически одинаковой величины.

В принципе, микрокапсулирование отличается от включения в волокна, главным образом, формой получаемых препаратов: при микрокапсулировании образуются сферические микрокапсулы, а при втором способе – нити.

Технология микрокапсулирования в настоящее время находит очень широкое применение в самых разнообразных отраслях – от производства лекарств и пищевых добавок до изготовления красящего слоя печатающих устройств или специальных антипиреновых присадок к полимерным композициям. Определенное развитие получили методы иммобилизации ферментов в полимерные микрокапсулы, а также довольно популярны эти приемы при иммобилизации животных и растительных клеток; что касается микроорганизмов, то таких работ еще мало.

Наполнение микрокапсул (внутреннее содержимое) может быть газовым, жидким, студнеобразным и твердым.

Весьма интересен прием совместного капсулирования клеток и экзогенных ферментов. Например, бактерии Gluconobacter oxydans, способные окислять глюкозу в глюконовую кислоту, требуют для этого хорошего снабжения кислородом. Однако при капсулировании даже при обильной аэрации они проявляли низкую глюкозооксидазную активность. При включении в полимер одновременно с клетками каталазы и добавлении в среду Н₂О₂ (донор кислорода) количество образующейся глюконовой кислоты резко увеличилась.

10.Иммобилизация металлохелатным способом

Для целей иммобилизации, как оказалось, можно использовать свойства ряда металлов образовывать хелатные комплексы. В этом случае не требуется дополнительной модификации носителя, и иммобилизация протекает быстро и в достаточно обычных условиях. Наиболее подходящими свойствами для иммобилизации обладают из переходных металлов титан и цирконий, оксиды которых не проявляют токсического действия. Этот метод иммобилизации разработан для ферментов на основе химии гидроксидов переходных металлов. В качестве носителя используют собственно гидроксид металла, который можно получить осаждением при гидролизе соответствующего хлорида. Молекула фермента иммобилизуется при образовании хелатов. При некоторых приемах используется совместное осаждение гидроксидов металлов с ферментами. Такое осаждение может привести к получению более активного продукта, чем при последующем добавлении фермента, так как поверхность частицы выпадающего в осадок гидроксида очень велика. Однако при этом необходимо учитывать возможную инактивацию фермента в результате инкубации при низких значениях рН.

Чтобы получить более высокую ферментативную активность, нужно оптимизировать процесс иммобилизации относительно некоторых важных условий: продолжительность иммобилизации, рН, соотношение количества фермента и носителя. Металлохелатный метод иммобилизации ферментов впервые разработал Новеис в университете г. Бирменген (Великобритания) в опытах иммобилизации на целлюлозе с применением диазотирования. Образование связи между полимером (целлюлоза), обработанным металлом, и ферментом (с появлением ферментативно активного производного) будет успешным лишь при выполнении следующих условий:

– в молекуле фермента должны присутствовать группы, способные выступать в роли лигандов;

• контакт этих групп с атомами металла стерически возможен;

– эти группы не должны находиться в области активного центра фермента;

– молекулы фермента, уже связанные с носителем, не должны располагаться слишком близко друг к другу.

Удельная активность получаемых препаратов на основе различных ферментов (глюкоамилаза, инвертаза, нуклеаза и др.) обычно довольно высокая (50–80 %). В результате иммобилизации металлохелатным методом константа Михаэлиса фермента, как правило не меняется. Использование хлорида титана приводило к получению препарата иммобилизованного фермента с большей активностью, чем в его отсутствии. Метод весьма прост и состоит из следующих стадий:

1. Взвесить в чашке 10 г. микрокристаллической целлюлозы.

2. Добавить 50 мл 15 %-ного (вес/объем) хлорида титана (IV) к 15 %-ной (вес/объем) НСl и хорошо перемешать.

3. Поместить смесь в вакуумный эксикатор с гидроксидом натрия и откачать воздух.

4. Выдержать смесь в сушильном шкафу при 45 ⁰С до полного высыхания (примерно 24 ч).

5. Промыть сухой остаток три раза буферным раствором (рН буфера обычно выбирают соответствующим оптимальной активности фермента), пока носитель не станет практически белым.

6. К промытому носителю добавить раствор фермента, содержащий 1 г белка, и перемешивать при 4 ⁰С в течение 18 ч.

7. Отцентрифугировать суспензию и промыть иммобилизованный фермент буфером, затем буфером, содержащим 1 М NaCl, еще раз этими же растворами, затем еще два раза буфером.

8. Ресуспендировать иммобилизованный фермент в буфере и хранить при 4 ⁰С.