Лабораторная работа 3 (2 часа)

Методы микроскопического исследования микроорганизмов. Приготовление живых препаратов микроорганизмов для микроскопирования

Цель работы: знакомство с техникой приготовления мазков и с методами окраски

Задачи работы: освоить методы приготовления препаратов микроорганизмов в живом и фиксированном состоянии, окраски препаратов.

Обеспечивающие средства -: микроскоп с осве­тителем предметные и покровные петля, капельница с дистиллированной водой, пробирка с физиологическим раствором, культуры микроорганизмов на жидкой и плотной питатель­ной среде, красители, вазелин. пипетки, бакте­риологическая игла, стеклянный мостик, ванночка.

Задание:

1. Обработать и приготовить предметные и покровные стекла.

2. Приготовить препараты микроорганизмов в живом и фиксированном состоянии.

3. Окрасить препараты, просмотреть под мик­роскопом и зарисовать в тетради.

Требования к отчету:

1. Описать методы приготовления препаратов микроорганизмов в живом и фиксированном состоянии.

3.После просмотра окрашенных препаратов под мик­роскопом зарисовать их в тетради.

Технология работы и методические указания

Для наблюдения микроорганизмов под микро­скопом необходимо соответствующим образом приготовить препарат на предметном стекле. Предметные стекла должны иметь толщину, не превышающую 1,2—1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изо­бражения краев диафрагмы осветителя в пло­скости препарата, т. е. нарушает фокусировку конденсора. Чрезмерная толщина стекла недопус­тима при работе с иммерсионным объективом.

Весьма существенным моментом является подготовка поверхности предметных стекол, что особенно важно при изготовлении фиксированных препаратов. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Для обезжиривания стекол их помещают в сосуд с притертой пробкой в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или спирта. Наиболее надежный способ обезжиривания - обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом.

Необработанные стекла можно обезжиривать следующим образом: рабочую поверхность стекла натереть мылом, которое затем удалить чистой сухой тканью.

Стекла из обезжиривающих веществ извлекают пинцетом. При работе стёкла держат пальцами за ребро.

Покровные стекла, применяемые обычно для приготовления препаратов живых бактерий и наблюдений с сухими системами, также должны быть тщательно вымыты и высушены.

Для определения формы и наблюдения за подвижностью микробов, их размножением, спорообразованием и прорастанием спор пользуются бактериоскопическими препаратами, приготовленными из живых микроорганизмов. Для этой цели можно пользоваться следующими препаратами:

Раздавленная капля. На чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды; дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствует необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими способности к движению и т. д.

В каплю воды вносится иглой небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешивается и покрывается, покровным стеклом.

Жидкие культуры (в бульоне) разводить не надо; берется капля зараженного бульона, наносится петлей на предметное стекло и покрывается покровным. Приготовленный препарат рассматривается под микроскопом с сухой системой с самым большим увеличением объектива и окуляра (40x15 или 60x15). Подвижность микробов лучше наблюдать в суточных бульонных культурах, спорообразование же, наоборот, в старых выдержанных культурах и преимущественно на плотных питательных средах.

Висячая капля. Висячей каплей удобнее пользоваться для наблюдения подвижности микробов, их развития, размножения, образования и прорастания спор и т. д. В висячей капле следует рассматривать суспензию живых микробов в жидкой питательной среде или физиологическом растворе (0,5% раствор NaCl). Суспензия микро­бов не должна быть густой, так как это затрудняет наблюдение изменений, происходящих в отдельных клетках.

Нанося каплю суспензии микробов петлей на покровное стекло, перевертывают его так, чтобы капля висела на нижней стороне стекла и накладывают его на предметное стекло с углублением по середине. Капля должна свободно висеть в углублении предметного, стекла, не касаясь его краев или дна. Края углубления предметного стекла предварительно необходимо смазать вазелином для герметичного заключения капли во влажной камере.

Висячую каплю начинают просматривать под малым увеличением х8. Находят край капли, выступающей в виде, темной округлой полосы на матовом фоне препарата. Переводят край капли в центр поля зрения и револьвером заменяют объектив малого увеличения па объектив средне­го увеличения (х-10). Макрометрическим винтом устанавливают фокус, поддерживают его микрометрическим винтом и наблюдают за характером движения бактерий в препарате. Устанавливают в микроскопе конденсор темного поля или вставляют между линзами обычного конденсора диск из черной бумаги. Устанавливают конденсор на мести и наносят на его верхнюю линзу каплю дистиллированной воды.

Готовят раздавленную каплю и помешают препарат па столик микроскопа. Налаживают темное поле, просматривают препарат.

Для выявления некоторых морфологических особенностей и количественного учета микроорганизмов, проверки чистоты культуры и для ряда других целей готовят фиксированные окрашенные препараты, которые могут храниться длительное время. Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы.

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное, стекло наносится капля воды, в нее. вносится иглой немного исследуемого материала, тщательно перемешивается и размазывается тонким слоем на поверхности стекла. Материал из жидких питательных сред, в том числе и из свернувшегося молока, берется петлей и не разводится в капле воды.

Высушивание мазка. Лучше всего сушить препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок 'Высыхает очень быстро. Если высушивание мазка замедленно, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформи­руются.

Фиксация. Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микробы на стекле; 2) обезвредить культуру; 3) облегчить восприятие окраски. Существует несколько способов фиксации мазка,

1. В пламени горелки мазки фиксируют следующим образом: стекло берут большим и указательным пальцем или пинцетом и троекратно про­водят через верхнюю часть пламени горелки (6 сек.).

2. Фиксация в жидкости

а) метиловым спиртом — 5 мин.;

б) этиловым спиртом. — 10 мин.;

в) смесью Никифорова — 10—15 мин.

г) ацетоном — 5 мин.;

д) парами кислоты и формалина — несколько секунд.

Окрашивание мазка. Механизм окраски микробов рассматривают в настоящее время как сложный физико-химический процесс взаимодействия красителя с содержанием бактериальной клетки. Различают простые и сложные, или дифференциальные методы окраски. Простая окраска заключается в нанесении па препарат, какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих целей употребляется или фуксин Пфейффера - красная краска, или щелочной раствор метиленовой синьки — голубая краска (синька Леффлера).

Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или из капельницы наносят одну из указанных красок. Количество краски должно быть умеренным — она должна покрывать весь мазок, но не стекать за пределы стекла. Фуксин выдерживают на мазке I—2 мин. синьку — 3—5 мин. Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на предметный столик микро­скопа и микроскопируют иммерсионным объективом (х90) в проходящем свете. Простой окраской пользуются для обнаружения в чистом материале микробов, определения их количества, формы и расположения.

Контрольные вопросы:

1. Как обрабатывать предметные и покровные стекла?

2. Из каких этапов складывается процесс изготовления мазка?

3. Как приготовить мазок из культуры на плотной питательной среде?

4. С какой целью и как высушивают мазки?

5. С какой целью и как фиксируют мазки?

6. Техника простого метода окраски мазков?

Библиографический список

1. Аникеев, В. В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] / В. В.Аникеев, К.А. Лукомская. – М. : Просвещение, 1977. – 146 с.

2. Аристовская, Т. В. Большой практикум по мик­робиологии [Текст] / Т. В. Аристовская [и др.]. – М. : Высш. шк., 1962. – 491 с.