Лабораторная работа 4(2 часа)

Дифференциальная окраска микроорганизмов по Грамму . Морфология бактерий.

Цель работы: знакомство с техникой окраски мазков по Грамму

Задачи работы: изучить методы окраски бактериальных препаратов

Обеспечивающие средства: микроскоп, осветитель, бактериологическая петля, пинцет, предметные и покровные стекла, кристаллизатор, стерильные пипетки, капельница с водой, генцианфиоле-товая краска, раствор Люголя, спирт 96°, фуксин-Пфейффера, иммерсионное масло, фильтровальная бумага,- марлевая салфетка, культуры: Вас.megaterium, E. colli, Proteus vulgaris на плотной питательной среде.

Задание:

1. Приготовить предметные стекла,

2. Приготовить фиксированный препарат трех культур: (одна грам—. вторая грам+ третья - исследуемая).

3. Окрасить препарат по Граму.

4. Просмотреть мазки под микроскопом с иммерсионной системой и зарисовать в тетрадь.

Требования к отчету:

1. Описать окраску бактериальных препаратов по Граму.

2. Описать препараты после просмотра мазков под и зарисовать в тетрадь

Технология работы и методические указания :

Одним из наиболее распространенных методов дифференциальной окраски является окраска по Граму. В зависимости от окраски по Граму все бактерии делятся на две группы. Грамположительные бактерии образуют прочное соединение с фиолетовой окраской, бактерии, не воспринимающие этой окраски, называются грамотрицательны ми.

Клеточная стенка грамоположительных бактерий содержит магниевую соль РНК, образующую прочное соединение, комплексное, с йодом и синей краской (генцианфиолетовым, метилфиолетовым и др.). Этот комплекс не разрушается при воздействии спирта, и бактерии сохраняют первоначальный фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не содержат магниевой соли РНК и поэтому не способны удержать фиолетовую окраску. Под действием спирта они обесцвечиваются, и окрашиваются в красный цвет фуксином Пфейффера.

Грамположительные — все виды семейства Сoccaceaе за исключением Micrococcus gonorrhoeal; все споровые формы (Вас. subtilis, Вас. mycoides и др.); молочнокислые стрептококки и палочки.

Грамотрицательные — Е. coli, Вас. aerogenes, Вас. proteus, Chromobact. prodigiosum флюоресцирующие бактерии Pg, fluores-

cens, Вас. cyanogenes и др.).

Окраска по Граму

1. На предметное стекло наносят рядом три мазка микробов: один грамположительный, дру­гой грамотрицательный - контроль, третий исследуемой культуры.

2. На фиксированный мазок наносят полоску фильтровальной бумаги, пропитанной краской генцианфиолета, и несколько капель воды. Можно нанести раствор генцианфиолетовой краски на 1—2мин. непосредственно на мазок.

3. Снимают пинцетом или сливают краску и, непромывая препарат водой, наносят раствор Люголя на 1 мин. до полного почернения.

4. Сливают раствор Люголя, не промывая водой, погружают препарат в стаканчик с 96° спиртом на 20—30 сек. Обесцвечивание производят до отхождення фиолетовых струй краски

г) ацетоном — 5 мин.;

д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.

Окрашивание мазка. Механизм окраски микробов рассматривают в настоящее время как сложный физико-химический процесс взаимодействия красителя с содержанием бактериальной клетки. Различают простые и сложные, или дифференциальные методы окраски. Простая окраска заключается в нанесении па препарат, какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих целей употребляется или фуксин Пфейффера — красная краска, или щелочной раствор метиленовой синьки — голубая краска (синька Леффлера).

Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или из капельницы наносят одну из указанных красок. Количество краски должно быть умеренным — она должна покрывать весь мазок, но не стекать за пределы стекла. Фуксин выдерживают на мазке I—2 мин. синьку — 3—5 мин. Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на предметный столик микро­скопа и микроскопируют иммерсионным объективом (х90) в проходящем свете. Простой окраской пользуются для обнаружения в чистом материале микробов, определения их количества, формы и расположения.

Контрольные вопросы:

1. Как обрабатывать предметные и покровные стекла?

2. Из каких этапов складывается процесс изготовления мазка?

3. Как приготовить мазок из культуры на плотной питательной среде?

4. С какой целью и как высушивают мазки?

5. С какой целью и как фиксируют мазки?

6. Техника простого метода окраски мазков.

Библиографический список

1. Аникеев, В. В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] / В. В.Аникеев, К.А. Лукомская. – М. : Просвещение, 1977. – 146 с.

2. Аристовская, Т. В. Большой практикум по мик­робиологии [Текст] / Т. В. Аристовская [и др.]. – М. : Высш. шк., 1962. – 491 с.

3. Методы экспериментальной микологии [Текст] / под общ. ред. В. И. Билай. – Киев : Наукова думка, 1990. – 156 с.