Лабораторная работа № 8 (2 часа)

ЗНАКОМСТВО С МИКРООРГАНИЗМАМИ ПОЧВЫ

Цель работы- знакомство с микроорганизмами почвы

Задачи работы –изучить правилами отбора почвенных проб из различных типов почв, изучить методы микробиологического анализа почвенных проб

Обеспечивающие средства: стерильные колбы, чашки Петри, пробирки со стерильной водой, питательные среды МПА, Чапека, резиновые перчатки, спиртовка, стерильные пипетки на 10, 2, 1 мл, стеклянные шпатели .

Задание:

1. Теоретическое ознакомление правилами подготовки инструментов, почвенных мешочков и бумажных пакетов для отбора почвенных проб, отбора почвенной пробы.

2. Проведение микробиологического анализа.

Требования к отчету:

1. Описание правил подготовки инструментов, почвенных мешочков и бумажных пакетов для отбора почвенных проб, отбора почвенной пробы.

2. Описать проведение микробиологического анализа почвы

Технология работы:

1. Ознакомиться с основными правилами подготовки инструментов, почвенных мешочков и бумажных пакетов для отбора почвенных проб, отбора почвенной пробы.

2. Ознакомится методами проведения микробиологического анализа почвы

Методические указания

Отбор почвенной пробы и подготовка образца к анализу

Микроорганизмы играют важную роль в процессе формиро­вания почвы. Численность микроорганизмов в почве во многом определяет ее плодородие. Изучение микроорганизмов почвы дает надежные результаты лишь в том случае, если правильно взяты почвенные образцы. До взятия почвенных образцов сле­дует сделать описание района исследования, указав характер рельефа, растительность и агротехнику. Необходимо дать под­робную характеристику почв.

При исследовании микроорганизмов в почвенных горизонтах делают почвенный разрез. Вертикальную стенку почвенного разреза зачищают каждый раз перед взятием образцов почвы. При изучении микрофлоры участка определенной площади гото­вят смешанные образцы почвы, отбирая пробы по диагонали участка на определенной глубине от поверхности. Микроорганиз­мы в почве распространены неравномерно, поэтому важно ана­лизировать большое число почвенных образцов. По Н. А. Красильникову, рекомендуется на участке площадью 100 м² анали­зировать 3 образца почвы, каждый из которых состоит из трех проб.

Почвенные образцы берут в стерильные пергаментные паке­ты или стеклянные банки, закрытые ватно-марлевыми пробками. Для отбора почвенных образцов удобно использовать металли­ческие совки, садовые ножи или небольшие лопаты, иногда поч­венный бур. Оборудование протирают ватным тампоном, смочен­ным спиртом, и обжигают на пламени. Для количественного уче­та почвенных микроорганизмов и грубого качественного анализа допустимо совки и ножи обтирать многократным втыканием их в исследуемый почвенный горизонт. Каждый образец почвы со­провождают этикеткой, где указывают дату взятия образца, рай­он участка и горизонт. Для взятия пробы почвы стерильным но­жом снимают верхний слой почвы 1,5—2 см, который может быть загрязнен посторонней микрофлорой. Далее совком или лопатой берут 100—200 г почвы и насыпают в пакет или банку. При изу­чении микроорганизмов пахотных почв образцы берут на всю глубину пахотного слоя. При изучении микроорганизмов на раз­ной глубине пробы почвы берут по генетическим горизонтам из почвенного разреза. В горизонте делают нишу и из нее извлека­ют почвенную пробу, начиная с нижнего горизонта к верхнему.

Почвенные образцы желательно анализировать в тот же день, так как количество микроорганизмов в них может измениться. Или же оставляют в холодильнике. Для диспергирования почвенных агрегатов и десорбции кле­ток микроорганизмов с поверхности почвенных частиц почву подвергают обработке ультразвуком (установка УЗДН-1, 15 кгц, О,ЗА), растиранию или встряхиванию на пропеллерной мешалке. Такая предварительная обработка почвы позволяет учесть значительно большее количество микроорганизмов (Звягинцев, 1969; Мишустин, 1975). Наиболее доступным приемом предвари­тельной обработки почвы, дающим хорошие результаты, следует считать растирание почвенного образца.

Исследуемую почву высыпают на стерильное стекло. (Стекло заранее протирают спиртом и обжигают на пламени.) Почву тщательно перемешивают шпателем, удаляя механические час­тицы и корни растений. Соблюдая стерильность, на часовом стекле отвешивают 10 г почвы и переносят ее в стерильную ступку.

Навеску почвы в ступке увлажняют до пастообразного со­стояния, добавляя 2—3 мл воды из первой колбы, содержащей 90 мл стерильной воды, и растирают 5 мин пальцем в резиновой перчатке. После растирания почву из ступки переносят с по­мощью воды во вторую сухую колбу, получают первое разве­дение— 1:10.

Почвенную суспензию в колбе встряхивают в течение 5 мин, дают отстояться 30 сек и далее стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии из колбы в пробирку № 1 с 9 мл сте­рильной дистиллированной воды, получают второе разведение — 1:100. Подобным образом готовят ряд последующих разведений почвенной суспензии —1:1000, 1:10000, 1:100000 1:1000000 и более, в зависимостиот предполагаемой численности микроорганизмов, учитывая тип почвы, генетический горизонт, сезон года, влажность почвенной пробы и т. д. Для приготовления каждого нового разведения почвенной суспензии следует пользоваться новой стерильной пи­петкой.

Посев

Для выделения и количественного учета бактерий почвенную суспензию высевают на одну из питательных сред пластинки МПА, КАА, почвенный агар, среду Эшби; для учета актиномицетов используют КАА или среду Чапека; для выделения и коли­чественного учета грибов и дрожжей применяют СА или моди­фицированную среду Чапека.

Питательную среду, расплавленную на водяной бане, соблю­дая стерильность, разливают в чашки Петри слоем 0,5—0,8 см. Для высева на каждое разведение почвенной суспензии готовят по 3—5 чашек Петри. После застывания среды для удаления ка­пель воды с крышек чашки Петри подсушивают в термостате при температуре 60— 70°С. На крышке чашки Петри пишут этикетку, указывая номер почвенной пробы, дату посева, разведение и повторность.

Стерильной пипеткой на 1 мл наносят каплю почвенной су­спензии из соответствующего разведения по центру питательной среды в чашке Петри и тщательно растирают ее стеклянным шпателем по всей поверхности агаровой пластинки. Для посева почвенной суспензии удобно пользоваться микропипетками на 0,1—0,2 мл. Засеянные чашки Петри переворачивают средой вверх и помещают в термостат при температуре 28—30°С.

Подсчет колоний бактерий на чашках Петри проводят через 3—5 суток, грибов и дрожжей — через 5—7, актиномицетов через 7—15. Наиболее точный результат получается при разви­тии на чашке Петри 50—200 колоний бактерий и актиномицетов и 30—50 колоний грибов. Следует иметь в виду, что при очень большом и' очень малом количестве колоний на чашках Петри могут быть значительные ошибки при подсчете микроорганиз­мов. Обычно почвенную суспензию высевают из 3—4 последовательных разведений на 3—5 чашек Петри из каждого разведе­ния. Для учета грибов почвенную суспензию высевают из раз­ведений на один-два порядка ниже, чем для учета бактерий и актиномицетов.

Подсчет колоний микроорганизмов на чашках Петри Для удобства подсчета колоний микроорганизмов дно чашки Петри разделяют тушью или чернильной пастой на секторы или сегменты. Если питательная среда прозрачна, подсчет колоний ведут в проходящем свете со дна чашки; в случае непрозрачной питательной среды колонии микроорганизмов подсчитывают не­посредственно с поверхности агара. Учтенные колонии отмечают точками на стекле. Подсчитав число колоний микроорганизмов, развившихся на чашках Петри по всем повторностям соответствующего разведе­ния, определяют среднее число колоний на чашке и далее делают пересчет количества микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой почвы по формуле:

а =бв/г

где а — число клеток микроорганизмов в 1 г воздушно-сухой почвы, б — среднее число колоний микроорганизмов на чашке Петри, в — соответствующее разведение, г — количество жидкости в пипетке. Для большей точности учета численности микроорганизмов параллельно микробиологическому анализу определяют процент влажности почвенной пробы и окончательно количество микро­организмов рассчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы.

Контрольные вопросы:

1. Какие существуют методы определения бактериального загрязнения почвы?

2. Для выделения бактерий, актиномицетов, дрожжей, грибов какие применяются питательные среды?

4. Как производится подсчет количества микробных тел?

5. На чем основан бактериологический анализ почвы?

Библиографический список

1. Аникеев, В. В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] / В. В.Аникеев, К.А. Лукомская. – М. : Просвещение, 1977. – 146 с.

Библиографический список

1. Аникеев, В. В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] / В. В.Аникеев, К.А. Лукомская. – М. : Просвещение, 1977. – 146 с.

2. Аристовская, Т. В. Большой практикум по мик­робиологии [Текст] / Т. В. Аристовская [и др.]. – М. : Высш. шк., 1962. – 491 с.

3. Биотехнология: принципы и применение [Текст] / под ред. И. Хиччитеса [и др.]. – М. : Мир, 1988. – 540 с.

4. Генкель, П. А. Микробиология с основами вирусологии [Текст] : учебное пособие для студентов биол. фак. пед. ин-тов / П.А. Генкель. – М. : Просвещение, 1974. – 270 с.

5. Егорова, Н. С. Основы учения об антибиотиках [Текст] : учебное пособие / Н. С. Егорова. – М. : Высш. шк., 1979. – 298 с.

6. Краткий определитель бактерий Берги [Текст] / под ред. Дж. Хоулта.. – М. : Мир, 1980. – 496 с.

7. Методы экспериментальной микологии [Текст] / под общ. ред. В. И. Билай. – Киев : Наукова думка, 1990. – 156 с.

8. Литвинов, М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов [Текст] / М. А. Литвинов. – Л.: Наука, 1967. – 303 с.

9. Шлегель, Т. Общая микробиология [Текст] / Т. Шлегель. – М. : Просвещение, 2002. – 490 с.