Лабораторная работа № 12 «количественное определение гликозилированного гемоглобина в крови человека»

Количественное определение гликозилированного гемоглобина в крови человека проводится с целью ранней диагностики сахарного диабета, в том числе его скрытых форм.

Метод основан на аффинной хроматографии гликозилированной и негликозилированной фракций гемоглобина в гемолизате крови. Используемый в микроколонках сорбент с привитой 3‑аминофенилборной кислотой обеспечивает на первой стадии специфическое связывание гликозилированного гемоглобина и его отделение от негликозилированной фракции. На второй стадии происходит полная элюция гликозилированной фракции за счет вытеснения сорбента сорбитолом. Измерение оптических плотностей обеих фракций при длине волны 414 нм позволяет рассчитать относительное содержание гликозилированного гемоглобина в анализируемой пробе.

Исследуемый материал: капиллярная или венозная кровь человека.

Реактивы: набор «Диабет-тест» для определения гликозилированного гемоглобина. В состав набора входят:

• раствор № 1 (антикоагулянт для забора крови): динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1 М; хлорид натрия, 0,9 %;

• раствор № 2 (гемолитик для гемолиза эритроцитов): Тритон Х-100, 0,1 %; азид натрия, 8 мМ;

• раствор № 3 (для приготовления рабочих буферных растворов I и II): ацетат аммония, 2,5 М; хлорид магния, 0,5 М; азид натрия, 80 мМ;

• раствор № 4 (для приготовления рабочих буферных растворов I и II): гидроксид натрия, 1 М;

• раствор № 5 (для приготовления регенерирующего раствора): уксусная кислота, 10 %;

• раствор № 6 (для приготовления консервирующего раствора): азид натрия, 80 мМ;

• сорбитол (тв.) (для приготовления рабочего буферного раствора II).

Материалы и оборудование: фотоколориметр ( = 414 нм), кювета (1 см), микроколонки, автоматические пипетки на 0,02-5,0 мл, мерные колбы на 500 и 1000 мл, мерный цилиндр на 200–1000 мл, пробирки.

Х о д р а б о т ы.

1. Приготовление рабочих буферных растворов

Перед проведением анализа готовятся рабочие буферные растворы I и II. Рабочий буферный раствор I применяется для уравновешивания микроколонок и элюции негликозилированного гемоглобина (рН=8,10,1). В мерную колбу на 500 мл количественно переносится содержимое флакона с раствором № 3, затем в колбу добавляется 300–400 мл дистиллированной воды и постепенно добавляется при постоянном перемешивании содержимое флакона с раствором № 4. Дистиллированной водой раствор доводится до метки и тщательно перемешивается.

Рабочий буферный раствор II используется для элюции гликозилированного гемоглобина. Для его приготовления в мерную колбу на 500 мл количественно переносится содержимое флакона с раствором № 3, добавляется 300–400 мл воды, затем постепенно при постоянном перемешивании добавляется содержимое флакона с раствором № 4. В эту же колбу вносится сорбитол, раствор тщательно перемешивается до полного растворения осадка, и объем раствора доводится до метки дистиллированной водой.

2. Приготовление регенерирующего раствора

Регенерирующий раствор необходим для удаления сорбитола и белков с сорбента. В мерную колбу на 1000 мл количественно переносится содержимое флакона с раствором № 5, объем доводится до метки дистиллированной водой при постоянном перемешивании.

3. Приготовление консервирующего раствора

Консервирующий раствор используется для консервации сорбента в микроколонках. Содержимое флакона № 6 количественно переносится в мерную колбу на 500 мл, объем доводится до метки дистиллированной водой при постоянном перемешивании.

4. Приготовление контрольного раствора гликозилированного гемоглобина

Во флакон с контрольным образцом гликозилированного гемоглобина автоматической пипеткой вносят 1,0 мл раствора № 2 и тщательно перемешивают, избегая вспенивания.

5. Приготовление образцов крови для анализа

Внимание! При работе с анализируемыми образцами цельной крови следует надевать одноразовые резиновые перчатки, т.к. образцы крови являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

В пластиковую пробирку вместимостью 1,5–2,0 мл вносят 1 каплю раствора № 1 и 0,5 мл крови. Перемешивают, отбирают пипеткой 0,02 мл и переносят в пробирку, содержащую 0,2 мл раствора № 2. Содержимое пробирки тщательно перемешивают 1–2 мин.