Хід роботи

1. Вийняти чашки Петри з термостата.

2. Вивчити візуально колонії мікроорганізмів, продивляючись чашку спочатку зі сторони дна у проходячому світлі, а потім із сторони кришки у відбитому світлі.

3. Підрахувати кількість колоній на чашці зі сторони дна чашки у минаючому світлі.

4. Визначити вміст мікроорганізмів в 1 г свіжого грунту за формулою: а = b х c х d, де a - кількість клітин в 1 г свіжого грунту, b - середня кількість колоній на чашці, c - розведення, з якого зроблений посів, d - кількість крапель в 1 мл суспензії.

5. Відібрати характерні, ізольовано розташовані колонії окремих типів, обвести їх із боку дна склографом, пронумерувати і досліджувати за схемою: розмір, форма, прозорість, колір, поверхня, рельєф, консистенція.

6. З частини відібраної ізольованої колонії приготувати мазок, провести забарвлення за Грамом і мікроскопіювати під імерсією, відмічаючи при цьому чистоту культури і морфологію мікроорганізму.

7. Із залишку відібраної ізольованої колонії зробити пересівання в пробірки зі скошеним МПА за допомогою бактеріологічної петлі для виділення чистої культури.

8. Пробірки з посівами помістити в термостат при відповідній температурі (для мезофільних - 25-35 ^оС, для термофільних - 50-60 ^оС, для психрофільних - 0-20 ^оС) на термін інкубації, обумовлений групою досліджуваних мікроорганізмів.

9. Пробірки з посівами вийняти з термостата і відмітити характер росту культури на скошеному агарі (якщо культура чиста, то по лінії посіву відмічається однорідний суцільний ріст мікроорганізмів).

10. Приготувати з отриманої культури мазок, провести забарвлення за Грамом і мікроскопіювати (якщо в мазку виявляються однотипні за морфологією і забарвленню мікробні клітини, то культура вважається чистою).

Питання для самоперевірки

1. В чому полягає суть візуального і мікроскопічного вивчення колоній?

2. Як класифікують колонії за розмірами, формою?

3. Чим визначається прозорість, колір колоній?

4. Яким може бути характер росту бактерій на рідких середовищах і в желатині за напрямом уколу?

5. Яку культуру мікроорганізму називають чистою культурою?

Лабораторна робота № 5 Вивчення вільноживучих азотфіксаторів

Мета роботи: дослідити грунтові зразки на наявність азотфіксуючих бактерій.

Теоретична частина

Щорічно з врожаєм сільськогосподарських культур в усьому світі з грунту виноситься 100-110 млн. т азоту. Повертається в грунт з азотними добривами близька 15% спожитого рослинами азоту. При такому співвідношенні спожитого і повернутого азоту запас його сполук в грунті міг би вичерпатися за 50-75 років, однак цього не відбувається. Пояснюється це тим, що дефіцит його в грунті значною мірою поповнюється за рахунок азоту, що зв'язується біологічним шляхом з атмосфери. Біологічна фіксація азоту здійснюється мікроорганізмами, що вільно живуть у грунті, і бактеріями, що співіснують у симбіозі, насамперед із бобовими рослинами.

За один рік в орному шарі грунту на площі 1 га вільноживучі бактерії накопичують 10 -15 кг азоту, а симбіотична асоціація бактерій із бобовими рослинами - до 150-200 кг. Засвоєний молекулярний азот відкладається в клітинах мікроорганізмів у вигляді білкових сполук, а частина його може виділятися в розчинній формі в грунт і засвоюватися рослинами. При розпаді відмерлих мікробних клітин він звільняється в хімічно зв'язаній формі і, мінералізуючись, стає доступним для живлення вищих рослин.

До вільноживучих мікроорганізмів, здатних фіксувати молекулярний азот атмосфери, відносять представників родів Clostridium, Azotobacter, Beijerinckia,, деякі спірили, сіркобактерії, дріжджі і синьозелені водорості.

Clostridium pasteurianum - типовий представник анаеробного процесу фіксації азоту. У молодих культурах цей мікроорганізм має вигляд прямих паличок із закругленими кінцями розміром 2,5-7,5х0,5 мкм. Палички розташовуються поодиноко або парами і мають багато джгутиків, розкиданих по всій поверхні клітини. При старінні клітини набувають характерної веретеноподібної форми з округлою спорою, розташованої ближче до одного з кінців. У протоплазмі клітин накопичується велика кількість крохмалеподібної речовини - гранульози, що дає з йодом блакитне забарвлення. Спори не забарвлюються.

Оптимум рН 5,6-7,4. Зброджує цукор з утворенням масляної й оцтової кислот, СО₂ і Н₂, зв'язує 10-12, а іноді 27 мг азоту на 1 г збродженого цукру.

Azotobacter chroococcum - найбільш поширений вид. Це рухливі клітини розміром 2-7х1,5-2,5 мкм, у молодих культурах паличковидні, з віком набувають кулястої форми.

Клітини з'єднані парами або більш великими групами й оточені великою слизуватою капсулою. Вони утворюють темно-коричневий пігмент, нерозчинний у воді. Характерною рисою виду є здатність використовувати крохмаль як єдине джерело вуглецю. При рості на середовищах із достатньою кількістю поживних речовин усередині клітин накопичується велика кількість зерен запасного поживного матеріалу. Зерна сильно заломлюють світло, завдяки чому при розгляді під мікроскопом незабарвлених препаратів вони мають зеленуватий відтінок. Це один із найбільш активних фіксаторів азоту. На 1 г збродженого цукру він засвоює до 20 мг атмосферного азоту.

Всі види азотобактера відносяться до аеробних мікроорганізмів, що найкраще розвиваються при вільному доступі повітря. Оптимум рН лежить у межах 7,2-8,0.

Бактерії з роду Beijerinckia поширені головним чином у грунтах тропічного поясу і майже не зустрічаються в грунтах помірної зони.

Обладнання і матеріали: поживне середовище Ешбі в колбах, грунт, шпатель для грунту, мікроскоп, скельця, барвники (забарвлення за Грамом).