Хід роботи

1. Приготувати поживне середовище С.М. Виноградського, що має наступний склад: вода водопровідна - 1000 мл; амоній сірчанокислий - 2,0 ; калій кислий фосфорнокислий - 1,0 г; магній сірчанокислий - 0,5 г; натрій хлористий - 2,0 г; залізо сірчанокисле - 0,4 г; кальцій сірчанокислий - 1,0 г

2. Середовище наливають у конічні колбочки місткістю 150—200 мл тонким шаром (0,5—1,0 см) і стерилізують в автоклаві 30 хв при 1 атм. При розливанні середовище необхідно добре струснути, тому що в ньому утворюється осад фосфорнокислого заліза.

3. В поживне середовище внести ґрунт (близько 0,5 г на колбу.) і помістити в термостат з температурою 25— 30° С.

4. Знайти в поживному середовищі продукти життєдіяльності бактерій, що нітрифікують - сполуки азотистої й азотної кислот, провівши якісні реакції з цинк-йод-крохмалєм або реактивом Гріса і дифеніламіном або пірогалолом відповідно.

Реакція з цинком-йод-крохмалем. У порцелянову чашечку капнути 1 краплю 20%-ого розчину сірчаної кислоти і додати до неї три краплі реактиву цинк-йод-крохмаль. До суміші додати 1 краплю досліджуваного поживного середовища. (У присутності NO₂ суміш забарвлюється в синій колір. Це відбувається внаслідок витиснення азотистою кислотою вільного йоду з йодисто-водневої солі. Вільний йод вступає у взаємодію з крохмалем, обумовлюючи синє забарвлення.

Реакція з реактивом Гріса. До 5 мл культури додати краплями реактив Гріса (оцтовокислий розчин суміші сульфанілової кислоти з α-нафтіламіном). Про наявність у культурі нітритів свідчить червоне забарвлення.

Реакція з дифеніламіном.

До 2 крапель міцної сірчаної кислоти в порцеляновій чашечці додати кристалик дифеніламіну. Після розчинення останнього, до суміші додати 1 краплю досліджуваного середовища. (Якщо в середовищі є NO₃, то суміш забарвлюється в темно-синій колір). Реакцію проводять після попереднього руйнування в середовищі нітритів. Для цього середовище кип'ятять з NН₄С1 у присутності 30%-ї оцтової кислоти. Після кип'ятіння проводять реакцію з дифеніламіном.

Реакція з пірогалолом. До 10 мл культури додати 0,2 г пірогалолу і добре перемішати. Опустивши кінчик піпетки в рідину, до суміші обережно долити 2 мл міцної сірчаної кислоти. У пробірку кинути кристалик (0,1 г) NaCl. На межі суміш – кислота спостерігається вскипання рідин і з'являється кільце пурпурного кольору. Інтенсивність забарвлення і ширина кільця вказують на кількісний вміст нітратів.

Питання для самоперевірки

1. Що називають нітрифікацією ?

2. Охарактеризувати і навести рівняння реакцій, що відбуваються в кожній з фаз нітрифікації.

3. Які мікроорганізми беруть участь у першій фазі нітрифікації ?

4. Які мікроорганізми беруть участь у другій фазі нітрифікації ?

5. Чому процес нітрифікації має розглядатися як один з найважливіших біологічних процесів ґрунту?

Лабораторна робота 9

Вивчення фосфоромінералізуючих бактерій

Мета роботи: одержати культури бактерій, що мінералізують фосфорорганічні сполуки, використовуючи середовище Менкіної і вивчити їхню морфологію.

Теоретична частина

Фосфор є одним з найважливіших елементів, необхідних для живлення рослин. Він входить до складу білків, фітину, лецитину, різних інозитфосфатів, нуклеінових кислот і нуклеотидів, гумусових сполук ґрунту, бере участь у процесах фосфорилювания вуглеводів і утворенні речовин, багатих енергією.

Значна частина фосфору знаходиться в ґрунті у формі сполук, недоступних для засвоєння вищими рослинами. Ці сполуки представлені в ґрунтах або складними фосфатами органічних речовин, або погано розчинними неорганічними сполуками типу фосфатів алюмінію, або заліза, кальцію. Фосфор ряду органічних і мінеральних добрив (фосфорит, апатит) також недоступний рослинам.

При розкладанні білкових речовин гнильними бактеріями фосфорорганічні сполуки поступово розщеплюються і переходять у форму фосфорної кислоти. Остання зв'язується з основами ґрунту, утворюючи важкорозчинні і малопридатні для живлення рослин солі кальцію, магнію, заліза, алюмінію й ін.

Мінералізація основної маси органофосфатів, нуклеопротеїдів і розчинення алюмо-, ферро- і трьохкальцієвого фосфатів, їхнє перетворення в доступну для рослин форму відбувається в результаті діяльності ґрунтових, ризосферних, прикореневих і кореневих мікроорганізмів. При мінералізації органофосфатів відбувається гідролітичне відщеплення фосфорної кислоти від органічних сполук і нуклеїнових кислот. Розкладання фосфатидів відбувається також шляхом гідролізу. Спочатку утворююься фосфорні ефіри, а потім йде розпад із вивільненням фосфорної кислоти.

Розчиненню фосфатів сприяють різні органічні і кетокислоти, що утворюються при неповному окислюванні вуглеводів чи при їх бродінні; азотна кислота, яка утворена бактеріями, що нітрифікують, і сірчана кислота, яка утворена сіркоокислюючими бактеріями.

У розкладанні органічних сполук фосфору і неорганічних фосфатів беруть участь представники різних груп мікроорганізмів: бактерії з родів Рseudoтопas і Васillus (Вас.теsentericus, Вас. теgаtheriит), гриби з родів Репісillіит, Аspergillus, Rhizopus, Аlternaria, деякі актиноміцети і дріжджі.

Типовим представником фосфорних бацил є Васillus megatherium var. phosphaticum. Вони представляють собою великі палички з закругленими кінцями, щільною оболонкою і зернистою протоплазмою. Розміри клітин варіюють у межах 5 - 6 мкм у довжину і 1,5 – 2 мкм у діаметрі. У молодій культурі клітини розташовані поодиноко і слабко рухливі; при старінні вони розташовуються попарно або короткими ланцюжками і втрачають рухливість. Клітини утворюють овальні ендоспори, розташовані з одного кінця. За Грамом забарвлюються позитивно, аероби, оптимум температури 27-35°С. На щільних середовищах утворюють бруднувато-білі колонії, які при старінні набувають жовтого або бурого забарвлення. На середовищі, що містить фосфорорганічні сполуки і крейду, навколо колоній утворюються зони просвітління за рахунок розчинення крейди фосфорною кислотою.

Обладнання і матеріали: розплавлений з лецитином 1% - розчин фенолу, стерильні чашки Петрі, пробірки (по 5 шт. на бригаду), стерильна вода, ґрунт, ваги, колби, мірний циліндр, піпетки, градуйовані на 1—2 мл і на 10 мл, мікроскоп, предметні скельця, барвники.