Хід роботи

1. Приготувати мінеральне середовище Ешбі: маніт (або глюкоза) ...20,0 г; калій фосфорний двохосновний ... 0,2 г; магний сірчанокислий ... 0,2 г; натрій хлористий ... 0,2 г; калій сірчанокислий ... 0,1 г; залізо сірчанокисле ... сліди; крейда ... 5,0 г; вода водопровідна ... 1000 мл.

2. Приготовлене поживне середовище розлити по колбах міскістю 100 -150 мл шаром 1-1,5 см і простерилізувати.

3. Внести у середовище невелику кількість грунту (0,5 г) або грунтової “бовтанки”.

4. Колбу помістити у термостат із температурою 22-25 ⁰С на 10-14 діб. Азотобактер краще розвивається в рідкому середовищі, в яке кладуть складений конусом фільтр

При наявності в грунті вільноживучих азотфіксаторів на 5-6-й день на поверхні поживного середовища, на фільтрі і на стінках колби з'являється плівка ( яка містить Агоbасtег сhroососсum), що швидко буріє , а на дні рідини, що до цього часу злегка стає каламутною, піниться і пахне масляною кислотою, накопичується Сlostridiит раstеurіапum.

5. Для мікроскопічного дослідження приготувати мазки з побурілої плівки і з дна колби.

Питання для самоперевірки

1. Представників яких родів, здатних фіксувати молекулярний азот атмосфери, відносять до вільноживучих мікроорганізмів?

2. До аеробних чи анаеробних мікроорганізмів відносяться всі види азотобактера?

3. Яке поживне середовище є кращим для розвитку вільживучих азотфіксаторів?

Лабораторна робота №6 Вивчення амоніфікуючих бактерій

Мета роботи : дослідити ґрунтові зразки на наявність амоніфікуючих бактерій, що розкладають білкові речовини з утворенням аміаку й сірководню.

Теоретична частина

Розкладання білків мікроорганізмами пов'язане з використанням цих речовин як джерела азотного і вуглецевого живлення, що витрачається на покриття енергетичних витрат і побудови тіла мікробів.

Амоніфікація - складний і різноманітний процес розпаду білка, що супроводжується утворенням вільного аміаку. Процес розпаду білків починається з їхнього гідролізу під впливом протеолітичних ферментів, що виділяються мікробами. Гідроліз йде поступово з утворенням ряду проміжних продуктів. Первинними продуктами гідролізу є пептони і поліпептиди. Вони утворюються в результаті розщеплення білкової молекули ферментом протеіназою. Пептони і поліпептиди під впливом поліпептидази розщеплюються до дипептидів, які в подальшому розкладаються дипептидазою до амінокислот.

Амінокислоти, що утворилися при розпаді білка, піддаються подальшому розщепленню під дією різних ферментів (дезаміназ, амідаз, дегідраз, декарбоксилаз). Цей процес починається з дезамінування амінокислот, у результаті якого утворюються аміак і різноманітні органічні сполуки відповідно до характеру самих амінокислот і навколишніх умов. Так, при розкладанні амінокислот жирного ряду утворюються мурашина, оцтова, пропіонова, масляна й інші кислоти; пропиловий, бутиловий, аміловий і подібні їм спирти.

В аеробних умовах ці продукти проміжного розпаду амінокислот піддаються окисленню і можуть бути цілком мінералізовані до кінцевих продуктів — аміаку, вуглекислого газу, води, сірководню і солей фосфорної кислоти.

Аміак, що утворюється при амоніфікації у водному розчині дає сильну основу NH₄ОН, що обумовлює деяке підлуговування ґрунту. Це сприяє активації протеаз і прискоренню розпаду білка до амінокислот.

В анаеробних умовах продукти проміжного розпаду амінокислот цілком не окислюються. У зв'язку з цим крім NН₃ і СО₂, накопичуються різні органічні кислоти, спирти, аміни й інші органічні сполуки, що мають отруйні властивості і неприємний запах. Органічні кислоти, які при цьому утворюються, розкладаються дуже повільно і накопичуються в ґрунті. Середовище підкислюється і, як наслідок цього, ферментативний розпад білків до амінокислот різко сповільнюється.

Швидкість мінералізації білка і нагромадження аміаку залежать від співвідношень вуглецю й азоту в ґрунті (С : N), температури, вологості, рН, аерації й інших факторів.

Найбільш активними учасниками розкладання білка є наступні мікроорганізми.

Аеробні бактерії. Вас. тусоides — невелика паличка довжиною 1,6—3,6 мкм, що дає спори овальної форми різної величини, рухлива; джгутики розташовані навколо всього тіла. Розвиваючись на твердих поживних середовищах утворюють характерні сланкі з поверхні колонії з пучками ниток, що нагадують колонії цвілей (звідси і назва mycoides-грибоподібний). Це одна з найбільш розповсюджених аеробних ґрунтових бактерій. Вас. теsentericus — невелика (1,5—5 мкм), рухлива, перетрихиально джгутикова, спороутворююча паличка, часто з'єднана в ланцюжки. Оптимум розвитку 35—45°С. На картопляних поживних середовищах утворює тонкі, сухі колонії зі зморшкуватою поверхнею, що схожі на брижі (звідси видова назва mesentericus). Вас. subtilis (сінна паличка) — коротка, ухлива, спороутворююча паличка з закругленими кінцями, величиною 3-5 х 0,6 мкм. Овальна спора розташована в центрі бактерій. На поживних середовищах утворює щільні, дрібні, зморшкуваті колонії, що зростаються з агаром. Температурний оптимум лежить у межах 37-50^оС, а температурний максимум росту 60^оС.

Факультативні анаероби. Рroteus vulgaris (протей) - дрібні (1,6—4 мкм), безспорові, рухливі палички, що сильно змінюють свою форму і розміри при розвитку на поживних середовищах різного складу. При розкладанні білка створюють слаболужну реакцію й утворюють сірководень та індол. Escherichia coli (кишкова паличка) — коротка (2—4х0,5 мкм), рухлива, безспорова паличка з закругленими кінцями. По Граму зафарбовується негативно. При рості на МПБ викликає загальне помутніння, на агарі дає сірувато-білий наліт.

Анаеробні бактерії. Сlostridium putrificum (гнильна паличка) - невелика, рухлива, спороутворююча паличка (5,6х0,8 мкм). Спори розташовуються на одному з її кінців, викликаючи стовщення у вигляді барабанної палички. Вуглеводи не зброджує. Розкладає білки лише в анаеробних умовах з утворенням великої кількості газів. Зустрічається в харчових продуктах, гної, ґрунті, консервах. У розкладанні білкових речовин активну участь приймають актиноміцети, цвілеві гриби, наприклад, Alternaria, Aspergillus, Trichoderma, Cladosporiuт й ін., а також найпростіші.

Обладнання і матеріали: стерильний МПБ у пробірках, смужки червоного лакмусового паперу, смужки фільтрувального паперу (0,5х5 см.), просочені розчином оцтовокислого свинцю (для визначення Н₂S), ґрунт, стерильна вода, колба, мірний циліндр, пробірки в штативах, бактеріологічна петля, піпетки стерильні на 1 мл, ваги, пальники, сірники.