Справа – еа-рок)
Недостатки этих методов: неоднозначность трактовки результатов (они зависят от условий постановки реакций, качества реагентов, определяются состоянием не только маркерных молекул, но и цитоскелета и др.), трудности, связанные с их стандартизацией и автоматизацией.
Современные методы определения количества лимфоцитов
В настоящее время для определения разных популяций и субпопуляций лимфоцитов крови используется реакция иммунофлуоресценции, или иммунофлуоресцентный метод.
Иммунофлуоресцентный метод позволяет идентифицировать различные клеточные популяции, несущие специфические поверхностные антигены (CD-антигены – от англ. – Clasters of differentiation) и соответственно этому окрашенные различными флуоресцентно меченными моноклональными антителами.
Принцип этого метода заключается в идентификации дифференцировочных маркерных антигенов на поверхности клеток (в большинстве случаев – на лимфоцитах). Для определения поверхностных маркеров в суспензию клеток добавляют моноклональные антитела против CD-антигенов клетки, меченные ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианатом), дающим зеленую флуоресценцию, или меченные ТРИЦ (тетраметилрома-дин-изотиоцианат) или фикоэритрином, дающими красное свечение. Окрашенные клетки анализируют на проточном цитофлуориметре или просматривают с помощью флуоресцентного микроскопа. При проточной цитофлуориметрии поток клеток проходит через тончайший капилляр, на который падает возбуждающий люминесценцию луч света. Каждая светящаяся клетка регистрируется специальным детектором в виде импульса. Прибор автоматически обрабатывает информацию и выдает результаты в виде гистограммы - графика распределения клеток с разной интенсивностью свечения (рис. 53).
Для просматривания под флуоресцентным микроскопом суспензию клеток переносят на предметное стекло, высушивают, наносят иммерсионное масло и смотрят препарат под объективом х90. Наблюдение следует проводить в затемненном помещении.
Иммунофлуоресцентные методы также используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным антигенам в сыворотках пациентов с аутоиммунными заболеваниями.
Рисунок 53. Проточная цитофлуориметрия
Используя широкий набор моноклональных антител, можно определить количественное содержание в крови не только Т- (CD2+, CD3+) и В-лимфоцитов (CD19+, CD20+, CD22+, CD72+), но и субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) и NK – клеток (CD16+, CD56+).
Кроме того, с помощью данного метода можно определять наличие на клетках врожденной и адаптивной иммунной систем рецепторов к цитокинам, другим медиаторам, а также экспрессию на них активационных маркеров и молекул клеточной адгезии. Перечень некоторых МКАТ, детектирующих указанные клетки и структуры, приведен в табл. 27.
Таблица 27. Моноклональные антитела и детектируемые с их помощью клетки и структуры
Антиген |
Распознаваемые клетки |
CD 1 |
кортикальные тимоциты |
CD 3, CD 2 |
Т - лимфоциты |
CD 4 |
Т-хелперы, моноциты |
CD 5 |
Т- лимфоциты и В - лимфоциты |
CD 7 |
все Т-клетки |
CD 8 |
ЦТЛ |
CD 10 |
лимфобласты |
CD 11b |
C3bi-рецептор C3 компонента комплемента |
CD 13 |
ранние миелоидные клетки |
CD 14 |
гранулоциты, моноциты |
CD 15 |
гранулоциты |
CD 16 |
NK-клетки, моноциты, гранулоциты |
CD 17 |
гранулоциты, моноциты, тромбоциты |
CD 18 |
лейкоциты |
CD 20 |
В-лимфоциты |
CD 21 |
В-лимфоциты |
CD 22 |
В-лимфоциты |
CD 24 |
В-лимфоциты, гранулоциты |
CD 25 |
рецептор интерлейкина-2 |
CD 45 RA |
В-лимфоциты, Т- лимфоциты (40%), NK-клетки |
CD 50 |
лейкоциты |
CD 54 (ICAM-1) |
активированный цитокинами эндотелий и др. клетки |
CD 56 (N-CAM) |
NK-клетки, некоторые Т- лимфоциты |
CD 71 |
рецептор трансферрина |
CD 72 |
B-лимфоциты |
CD 95 (FAS) |
маркер готовности клеток к апоптозу (FAS – рецептор) |