Функциональная оценка в-лимфоцитов

Определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях является одним из наиболее важных интегральных показателей функциональной полноценности В-лимфоцитов и всей системы регуляции гуморального адаптивного иммунитета.

Традиционно концентрацию сывороточных иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. В настоящее время этот метод все еще находит свое применение, предпочтение отдается моноклональным антителам против отдельных антигенных детерминант (эпитопов), характерных для отдельных классов иммуноглобулинов.

Принцип метода Манчини заключается в том, что образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агара, в которых содержатся антитела против IgM, IgG, IgA в стандартной концентрации. Иммуноглобулины, содержащиеся в исследуемой сыворотке, диффундируют в агар и при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитации. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Окончательный размер кольца преципитации зависит от концентрации соответствующих иммуноглобулинов. Метод Манчини позволяет определить концентрацию иммуноглобулинов, равную 10 мкг/мл. Ошибка метода составляет 10%.

Лабораторная оценка нарушений врожденного иммунитета

Для диагностики нарушений врожденного иммунитета обычно определяют фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и оценивают состояние системы комплемента.

Оценка фагоцитарной активности

Наиболее информативными для оценки фагоцитарной системы следует считать фагоцитарный индекс, фагоцитарное число (отражает поглотительную способность нейтрофилов) и индекс бактерицидности (отражает переваривающую способность нейтрофила).

Фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.

Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число бактерий или частиц латекса, поглощенных в расчете на один нейтрофил.

Также проводятся тесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение).

При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 37⁰ С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов, поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия – НСТ-тест позволяет оценить метаболическую активность гранулоцитов крови, выявляет резервные возможности внутриклеточных систем фагоцитов. НСТ-тест основан на восстановлении поглощенного лейкоцитами крови растворимого красителя – нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан черного цвета (внутриядерные включения – глыбки диформазана) под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции, инициирующей процесс стимуляции фагоцитоза.

Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия).

В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий E. coli или раствор пирогенала (липополисахарид S. typhi ) в разведении 1:10. На другое обезжиренное стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 минут. Готовят мазки, высушивают, фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая процент лейкоцитов с гранулами восстановленного НСТ (диформазан черного цвета).

Оценка состояния системы комплемента

Определение содержания компонентов и ингибиторов системы комплемента проводится, главным образом, при подозрении на генетически обусловленные дефекты этой системы. Однако в последнее время эти тесты находят все более широкое применение и для оценки характера течения и эффективности терапии иммунокомплексных заболеваний.

Раньше состояние системы комплемента оценивали, главным образом, с использованием громоздкой гемолитической системы, для чего использовали концентрации сывороток крови, которые вызывают 50%-100% гемолиз в гемолитической системе, что позволяло получить суммарное представление об активности системы комплемента. В настоящее время определение индивидуальных факторов системы комплемента чаще проводится методом ИФА с помощью моноклональных антител.

Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов. Экзогенные и эндогенные антигены могут образовывать в организме человека иммунные комплексы с соответствующими антителами, что может стать причиной системной или органной патологии. Иммунные комплексы образуются при реакции антител (чаще всего класса IgM или IgG) с антигенами. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) имеют обычно три составные части: антиген, антитело и связавшийся с ними комплемент (рис. 56). Образование иммунных комплексов в организме является физиологической реакцией иммунитета, при которой активизируются механизмы, предназначенные для нейтрализации и удаления антигенов из кровеносного русла или из тканей.

Если концентрация иммунных комплексов не превышает допустимых пределов, организм способен эффективно их ликвидировать, при этом не возникает никакого вреда. В противном случае, в частности, при системных аутоиммунных, инфекционных заболеваниях, аллергии, а также при злокачественных новообразованиях ЦИК оседают в некоторых тканях и органах, образуя депозиты и вызывая за счет активации комплемента воспалительно-деструктивный процесс.

При физиологических условиях скорость образования иммунных комплексов относительно мала по сравнению со способностью организма к их элиминации. Поэтому в норме уровень ЦИК в сыворотке крови является достаточно низким (до 55 у.е.). В крови иммунные комплексы могут быть связаны с эритроцитами, а также присутствуют в свободной форме в плазме (ЦИК). Связанные с эритроцитами комплексы реже оказывают повреждающее действие, поэтому больший интерес представляет определение уровня свободных ЦИК.

ЦИК, содержащиеся в сыворотке крови, осаждаются центрифугированием, а затем проводят спектрофотометрию на 450 нм для определения концентрации белка (она соответствует концентрации ЦИК).

Рисунок 56. Определение циркулирующих иммунных комплексов