5. Биосинтез углеводов
Если микроорганизмы – автотрофы, то исходным веществом для синтеза углеводов является СО2. Синтез углеводов происходит у большинства автотрофов в цикле Кальвина (восстановительный пентозофосфатный цикл), который функционирует так же, как и у растений.
Для цикла Кальвина характерны два специфических фермента, не участвующие в других метаболических путях. Это:
1) фосфорибулокиназа, превращающая рибулозо-5-фосфат при участии АТФ в рибулозо-1,5-дифосфат, который затем выступает в качестве акцептора СО2;
2) рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза, катализующая реакцию фиксации СО2 рибулозо-1,5-дифосфатом с образованием двух молекул 3-фосфоглицериновой кислоты. Последняя подвергается серии последовательных ферментативных превращений, ведущих к образованию молекулы глюкозы.
У бактерий-гетеротрофов на среде с неуглеводными предшественниками (например, аминокислотами, глицерином, молочной кислотой) синтез углеводов осуществляется с использованием реакций гликолитического пути, идущих в обратном направлении. Этот процесс называется глюконеогенезом. Но некоторые ферментативные реакции гликолитического пути необратимы (реакции, катализируемые гексокиназой, фосфофруктокиназой и пируваткиназой). Поэтому в клетках гетеротрофных прокариот, способных использовать двух- и трехуглеродные соединения, сформировались специальные ферментативные реакции, позволяющие обходить необратимые реакции гликолитического пути. Одной из таких обходных реакций у бактерий E. coliи других бактерий является превращение пирувата в фосфоенолпируват (ФЕП) под действием фосфоенолпируватсинтетазы:
Фосфоенолпируватсинтетаза
Пируват
+ АТФ + Н2О
→
ФЕП + АМФ
Образовавшиеся таким образом углеводы используются для синтеза олиго- и полисахаридов. Биосинтез полисахаридов осуществляется путем трансгликозилирования, т. е. путем переноса остатков моносахаридов на конец растущей цепи полисахарида. Этот процесс всегда сопровождается затратой энергии.
38. Изменчивость микроорганизмов; понятие об адаптации микроорганизмов; модификационная (фенотипическая) изменчивость у бактерий; значение адаптивных модификаций. Генетика – наука о наследственности и изменчивости живых организмов. В отличие от классической генетики, генетика бактерий – относительно молодая отрасль микробиологии, первые работы по которой появились в начале 1940-х годов. Термин «мутация» введен Г. де Фризом (1901), изучавшим изменчивость и наследственность у растений и определившим мутацию как «скачкообразное изменение наследственного признака». Это понятие М. Бейеринк (1912) позднее распространил и на бактерии. Мутация – событие редкое и обычно спонтанно происходит с частотой 1·10–4–1·10–10. В результате постановки ряда экспериментов были получены данные, свидетельствующие о том, что у бактерий мутации носят спонтанный и ненаправленный характер. К их числу относятся, прежде всего, эксперименты С. Лурия, М. Дельбрюка, Г. Ньюкомба и супругов Е. и Дж. Ледерберг. В 1943 г. С. Лурия и М. Дельбрюк доказали спонтанное возникновение мутантов бактерий с помощью флуктуационного теста. Принцип флуктуационного теста заключается в следующем: если устойчивые мутанты возникают при контакте с фагом (изменчивость адаптивная), то каждая культура независимо от того, из какой части она была взята, должна содержать приблизительно одинаковое количество устойчивых клеток. Если же устойчивые бактерии возникли спонтанно, до обработки фагом, то следствием этого является тот факт, что их количество в засеянных независимых культурах (100 пробирок) будет отличаться от количества, полученного при анализе образцов, из одной и той же (100 мл) культуры. Независимо полученные результаты свидетельствуют о том, что культуры разного происхождения действительно обнаруживают более резкие колебания (флуктуации) в содержании устойчивых клеток (0, 103, 62, 3, 159 и т. п.), чем пробы, взятые из одного и того же образца (142, 140, 155, 146, 110 и т. п.), что подтверждает гипотезу о спонтанном характере возникновения мутаций. В 1949 г. Г. Ньюкомб поставил другой по методическому подходу эксперимент с фагом Т1 и бактериями E. coli, который впоследствии получил название перераспределительного теста. Принцип, положенный в основу данного теста, предполагает, что устойчивые клетки возникают вследствие спонтанных мутаций до контакта с фагом, и на чашках, где бактерии были перераспределены, должно формироваться больше устойчивых колоний, чем на контрольных чашках, так как каждая клетка из микроколонии устойчивых бактерий после перераспределения сформирует колонию, устойчивую к фагу Т1.
В 1952 г. супруги Е. и Дж. Ледерберг предложили способ непрямого отбора мутантов методом реплик, или отпечатков, и использовали его для доказательства спонтанной природы возникновения мутаций у бактерий. Мутационная изменчивость относится к генотипической, или наследственной, изменчивости, так как при этом возникающие изменения в молекуле ДНК бактерий передаются по наследству. Кроме генотипической, существует модификационная изменчивость, которая рассматривается как ответ на изменение условий окружающей среды и наблюдается до тех пор, пока действует фактор, вызывающий эти изменения. Модификационная изменчивость (ее называют еще фенотипической изменчивостью) проявляется на уровне фенотипа и не затрагивает генотип. Фенотипическая изменчивость проявляется у подавляющего большинства особей в популяции, в то время как при мутационной изменчивости изменение генотипа происходит только у единичных клеток. Существует несколько проявлений модификационных изменений. Наиболее известны адаптивные модификации, т. е. ненаследственные изменения, полезные для организма и содействующие его выживанию в изменившихся условиях. У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.). Считается, что адаптивные модификации расширяют возможности организма к выживанию и размножению в более широком диапазоне условий внешней среды. Возникающие модификации могут быть относительно стабильными, они могут сохраняться на протяжении нескольких поколений или, наоборот, очень лабильными. Тем не менее, не все модификации можно рассматривать как адаптивные. При интенсивном воздействии многих агентов наблюдаются ненаследуемые изменения, случайные по отношению к вызвавшему их воздействию.
Значение адаптивных модификаций: - вносят определенный вклад в процесс эволюции; - расширяют возможности организма к выживанию и размножению в более широком диапазоне условий внешней среды. Возникающие в этих условиях наследственные изменения подхватываются естественным отбором и таким путем происходит более активное освоение новых экологических ниш и достигается более эффективная приспособляемость к ним.
39. Мутации у бактерий: классификация мутаций и молекулярные основы мутационного процесса; мутагенные факторы физической, химической и биологической природы. Практическое использование мутаций.Практическое использование мутаций. Мутации – изменения, которые возникают в генетическом аппарате бактерий и передаются по наследству. Они бывают спонтанные и индуцированные. Мутации, возникающие в популяции бактерий без целенаправленного экспериментального вмешательства, называют спонтанными. Индуцированные мутации возникают с помощью воздействия тех или иных факторов – мутагенных агентов, которые существенно повышают частоту возникновения мутаций. Мутагенами могут быть химические, физические и биологические агенты, действующие на молекулу ДНК бактерий. К ним, например, относятся: УФ-лучи, ионизирующее излучение (физические агенты); азотистая кислота, нитрозогуанидин, аналоги азотистых оснований, некоторые антибиотики, акридиновые красители, сернистый иприт (химические агенты); транспозоны, IS-элементы, бактериофаг Mu (биологические агенты). Мутагенные агенты характеризуются неспецифичностью действия, т. е. используя какой-то мутаген, нельзя надеяться на выделение клеток с определенным типом или характером мутаций. Мутагены способны только повышать частоту возникновения мутаций.
Классификация мутаций: По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на прямые и обратные (или реверсии). Мутации, которые приводят к утрате или изменению какой-то функции клетки, относятся к классу прямых, так как они вызывают появление у клеток другого фенотипа, который отличает их от бактерий дикого типа. Например, бактерии E. coli, способные в норме сбраживать лактозу (Lac+- фенотип), могут утрачивать данный признак, и поэтому мутация Lac+ → Lac– будет считаться прямой.В результате обратной мутации у мутантного организма восстанавливается исходный (или дикий) фенотип: Lac– → Lac+ – обратная мутация, или реверсия.По фенотипическим проявлениям мутации подразделяют на:1) морфологические, в результате которых изменяется ряд морфологических признаков (наличие капсулы, утрата жгутиков, изменение особенностей колоний и др.);2) биохимические (например, ауксотрофные; обеспечивают устойчивость к ингибиторам, антибиотикам, бактериоцинам, ядам или бактериофагам; связаны с чувствительностью к повышенной температуре (условно-летальные); нарушают регуляцию или синтез ферментов катаболизма либо анаболизма и др.)В соответствии с характером изменений в первичной структуре ДНК различают точковые и хромосомные мутации. Точковые мутации – генные мутации, приводящие к замене, вставке или выпадению одной пары нуклеотидов.
Мутации такого рода могут быть двух типов: • транзиции, в результате которых происходит замена пурина на другой пурин или же пиримидина на другой пиримидин (простая замена). • трансверсии - приводят к замене пурина пиримидином, и наоборот (сложная замена). Мутации со сдвигом рамки считывания представляют собой делеции или вставки одной или нескольких нуклеотидных пар.
Мутации, затрагивающие множество пар нуклеотидов, называют хромосомными. Они делятся на дупликации, делеции, инсерции, инверсии, транслокации. Дупликации – возникновение в данной нуклеотидной последовательности одного или, чаще, нескольких повторов. Делеции – утрата двух или нескольких пар оснований. Инверсии – изменение порядка нуклеотидов в ДНК на обратный по отношению к ориентации в штаммах дикого типа, они возникают обычно в результате рекомбинации с переворотом (flip-flop). Транслокации – перенос фрагмента ДНК в новое положение.
40. Общая характеристика способов генетического обмена у бактерий; трансформация: открытие, механизм, стадии трансформации, компетентность клеток при трансформации, практическое значение трансформации. Генетическая информация в бактериальных клетках заключена в НК хромосомы ( или хромосом), состоящей из нескольких тысяч генов, а также во внехромосомных генетических элементах ( структурах), называемых плазмидами. В настоящее время описаны четыре способа генетического обмена у бактерий : трансформация (1928), конъюгация (1946), трансдукция 1952) и слияние протопластов (1976). Трансформация – перенос генетической информации, при котором ДНК, выделенная из клетки-донора, поступает в клетку-реципиент.Явление трансформации было открыто Ф. Гриффитом в 1928 г. в опытах на пневмококках (Streptococcus pneumoniae). В классической работе О. Эвери, К. Мак-Леода и М. МакКарти, опубликованной в 1944 году, было установлено, что трансформирующим началом является ДНК. Процесс трансформации, начиная с момента добавления ДНК из клеток донорного штамма к культуре реципиента, в общих чертах включает следующие этапы, или стадии.
1. Адсорбцию донорной ДНК на поверхности реципиентной клетки. На этом этапе трансформирующий фактор чувствителен к ДНКазе. 2. Поглощение донорной ДНК реципиентной клеткой. Причем ДНК может поглощаться только теми клетками, которые находятся в состоянии компетентности. На этой стадии ДНК уже нечувствительна к действию ДНКазы. 3. Образование в реципиентной клетке однонитевых фрагментов донорной ДНК. 4. Синапс одноцепочечной донорной ДНК с двухцепочечной хромосомой реципиента. 5. Интеграцию части донорной молекулы ДНК в реципиентную ДНК в результате рекомбинации. 6. Репликацию рекомбинантной молекулы ДНК. 7. Экспрессию генов, переданных от донора, т. е. образование трансформантов.
Компетентностью при генетической трансформации обычно называется способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК. Состояние компетентности регулируется множеством генов (у бацилл их не менее 40), которые принято подразделять на ранние и поздние. К ранним относятся гены «настраивающие» (подготавливающие) клетку на приобретение компетентности; к поздним – гены, детерминирующие механизмы связывания и поглощения ДНК, преобразования (или процессинга) ДНК по ходу поглощения; и наконец, гены, управляющие рекомбинацией трансформирующей ДНК с хромосомой реципиентной клетки.Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами: • обладают сниженным уровнем метаболизма; • более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции; • сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием; • меньшими размерами, чем некомпетентные; • изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны; • повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой обработке; • сниженным поверхностным зарядом. Широко используется также способ индукции компетентности за счет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При этом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации.Трансформация имеет практическое использование:• для картирования бактериальной хромосомы;• для конструирования промышленно-полезных штаммов микроорганизмов; • для введения в геном бактерий определенных маркеров или элиминирования нежелательных мутаций; • как один из этапов получения трансгенных растений; • может выступать в качестве модели в различных генетических и молекулярно-биологических экспериментах на изолированной ДНК.
41. Бактериальная конъюгация: открытие, механизм, особенности, стадии, практическое значение.Конъюгация – генетический обмен, который сопровождается переносом генетической информации от клетки-донора к клетке-реципиенту, он происходит при их непосредственном контакте. Явление конъюгации было открыто Дж. Ледербергом и Э. Татумом в 1946 г. в экспериментах с полиауксотрофными штаммами бактерий E. сoli (рис. 3). В 1949 г. Б. Дэвис получил дополнительные данные, которые также доказывали, что для образования прототрофов необходим контакт родительских клеток. Позднее У. Хейс показал, что существуют бактерии мужского и женского типа и вклад их в конъюгацию не равнозначен. Рекомбинанты наследуют большинство своих признаков от реципиента, а от донора получают только отдельные фрагменты генома.
Женская бактериальная клетка, обозначается как F--штамм [бактерии]. (F- fertility). Это бактериальная клетка, которая не содержит F-фактора и участвует в конъюгации в качестве рецепиента; рекомбинация может происходить только в Ж.б.к. Мужская бактериальная клетка, F+-штамм [бактерии]. Обозначается как бактериальная клетка, которая несет половой F-фактор и участвует в процессе конъюгации в качестве донора генетического материала; рекомбинация в М.б.к. никогда не происходит. F-фактор представляет собой внехромосомную кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, которая автономно реплицируется, его относят к плазмидам. При конъюгации частота передачи F-фактора близка к 100%. Таким образом, клетки-реципиенты превращаются в потенциальных доноров. В зависимости от состояния F-фактора различают два типа донорных клеток: - F+-доноры, у которых F-фактор находится в автономном от хромосомы состоянии. При скрещивании обычно передается только F-фактор; - Доноры Hfr- типа (highfrequencyofrecombination (высокая частота рекомбинации), у которых F-фактор интегрирован в хромосому. При скрещивании передаются хромосомные гены. Интеграция F-фактора в бактериальную хромосому обратима. F- факторы, которые содержат фрагменты хромосомной ДНК, получили название F́ - факторы (прим). Такие факторы могут нести в своем составе один ген – это малые F́-факторы, если несут до половины бактериальной хромосомы – это большие. F́- факторы с высокой эффективностью передаются при конъюгации клеткам – реципиентам, и переносят при этом бактериальные гены, которые включены в их состав. Такой тип передачи генов получил название сексдукции, или F- дукции. Механизм. На первых этапах после смешивания донорных и реципиентных клеток в результате случайных контактов формируются конъюгационные пары. Перенос генетического материала от донора к реципиенту происходит только в том случае, когда образуются эффективные конъюгационные пары. Структуры, с помощью которых обеспечивается образование эффективных конъюгационных пар, были открыты после выделения F-донорспецифических бактериофагов. В отличие от всех известных бактериофагов, которые адсорбируются на клеточной стенке, эти вирусы адсорбируются на половых ворсинках, или F-пилях. Половые пили обеспечивают взаимное узнавание при контакте донорных и реципиентных клеток. Они прикрепляются к специфическим рецепторам, находящимся на поверхности реципиентных клеток. Благодаря способности половых пилей сокращаться, клетки донора и реципиента вступают в контакт «клеточная стенка к клеточной стенке», а затем между клетками возникает более сложное образование – конъюгационный мостик, по которому ДНК переходит из клетки-донора в клетку реципиента. Во время конъюгации в донорных клетках осуществляется репликация ДНК по типу «катящегося кольца» или «разматывающегося рулона». После репликации в реципиентной клетке двухцепочечная ДНК вступает в гомологичную рекомбинацию с ДНК реципиентной клетки. Образуются рекомбинанты, которые при данном способе обмена генетической информацией называются трансконъюгантами. Таким образом, в процессе конъюгации можно различить следующие стадии: • образование неэффективных пар; • образование эффективных конъюгационных пар; • перенос генетического материала из донорных клеток в реципиентные; • постконъюгационный синтез донорной ДНК в реципиентной клетке; • гомологичная рекомбинация перенесенного фрагмента донорной ДНК с ДНК реципиентной клетки.
Конъюгация используется в следующих направлениях:1. Передача многих генетических маркеров из одних клеток в другие. Показано, что при конъюгации вся хромосома бактерий E. coli передается за 100 мин. 2. Метод конъюгационного скрещивания удобен для картирования хромосомы. Он был первым методом, который использовался для этих целей. Карта хромосомы у бактерий строится в минутах.3. Изучение генетического аппарата у бактерий. 4. Конъюгация эффективно происходит в природе и поэтому является одним из факторов изменчивости бактерий.
42. Бактериальная трансдукция: открытие, механизм, особенности, типы трансдукции, использование трансдукции в практических целях.Трансдукция – перенос генетической информации (хромосомных генов или плазмид) от клетки-донора к клетке-реципиенту; происходит при участии бактериофагов. Трансдукция основана на том, что в процессе размножения фагов в бактериях могут образовываться фаговые частицы, которые наряду с фаговой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной ДНК. Такие фаговые частицы называются трансдуцирующими. По морфологии и адсорбционным свойствам они ничем не отличаются от обычных фаговых вирионов, но при заражении ими новых клеток передают генетические детерминанты предыдущего хозяина. Таким образом, чтобы осуществить трансдукцию, необходимо размножить фаг на клетках штаммадонора, а затем заразить полученным фаголизатом клетки-реципиента. Трансдукция была открыта Дж. Ледербергом и Н.Циндером в 1952 у Salmonellatyphimurium и фага Р22.Принято выделять два типа трансдукции: 1) общая (генерализованная, неспецифическая); 2) специфическая (или ограниченная). При генерализованной трансдукции может трансдуцироваться любой фрагмент бактериальной хромосомы примерно с одинаковой частотой. При специфической трансдукции могут переноситься строго определенные гены. При общей трансдукции может переноситься любой фрагмент бактериальный хромосомы с частотой 10–5–10–6. Количество бактериальной ДНК, которое может переноситься фагом, обычно составляет 1–2 % от всей клеточной ДНК. Исключение составляет бактериофаг РBS1 B. subtilis, который может трансдуцировать до 8 % генома хозяина. В процессе общей трансдукции бактериальный вирус является только «пассивным» переносчиком генетического материала бактерий и содержит только фрагменты бактериальной ДНК. Механизм рекомбинации у трансдуцируемых бактерий соответствует общепринятой схеме (гомологичной рекомбинации). Специфическая трансдукция была открыта в 1956 г. М. Морзе и супругами Е. иДж. Ледерберг. Для специфической трансдукции характерно: 1) каждый трансдуцирующий фаг передает только определенную, строго ограниченную область бактериальной хромосомы; 2) фаг не только переносит генетический материал, но и обеспечивает его включение в бактериальную хромосому; 3) вирус включает фрагмент ДНК бактерий-доноров в свой геном и передает ее в ДНК бактерий-реципиентов в результате встраивания в хромосому.Наиболее известным примером специфической трансдукции является трансдукция, которая выполняется фагом λ, который способен заражать клетки бактерий E. coli с последующей интеграцией его ДНК в геном бактерий. Использовать трансдукцию можно в следующих направлениях: • для трансдуцирования плазмид и коротких фрагментов хромосомы донора; • для конструирования штаммов заданного генотипа; • для точного картирования бактериальных генов, установления порядка их расположения в оперонах, что осуществляют с помощью комплементационного теста.
43. Мутагенные факторы биологической природы: мобильные генетические элементы бактерий (IS-элементы, транспозоны, фаги-транспозоны), их значение.
Мутации – изменения, которые возникают в генетическом аппарате бактерий и передаются по наследству. Они бывают спонтанные и индуцированные. В среднем частота спонтанных мутаций составляет 10–4–10–10. Мутагенами могут быть химические, физические и биологические агенты, действующие на молекулу ДНК бактерий. К ним относятся: (физические) УФ-лучи, ионизирующее излучение, (химические) азотистая кислота, нитрозогуанидин, аналоги азотистых оснований, некоторые антибиотики, акридиновые красители, сернистый иприт, (биологические) транспозоны, IS-элементы, бактериофаг Mu и др.
Классификация мутаций:
1)По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на прямые и обратные (или реверсии). Мутации, которые приводят к утрате или изменению какой-то функции клетки, относятся к классу прямых, так как они вызывают появление у клеток другого фенотипа, который отличает их от бактерий дикого типа. Например, бактерии E. coli, способные в норме сбраживать лактозу (Lac+- фенотип), могут утрачивать данный признак, и поэтому мутация Lac+ → Lac– будет считаться прямой.В результате обратной мутации у мутантного организма восстанавливается исходный (или дикий) фенотип: Lac– →Lac+ – обратная мутация, или реверсия.
2)По фенотипическим проявлениям мутации подразделяют на:1) морфологические, в результате которых изменяется ряд морфологических признаков (наличие капсулы, утрата жгутиков, изменение особенностей колоний и др.);2) биохимические (например, ауксотрофные; обеспечивают устойчивость к ингибиторам, антибиотикам, бактериоцинам, ядам или бактериофагам; связаны с чувствительностью к повышенной температуре (условно-летальные); нарушают регуляцию или синтез ферментов катаболизма либо анаболизма и др.)В соответствии с характером изменений в первичной структуре ДНК различают точковые и хромосомные мутации.
В настоящее время расшифрованы механизмы действия некоторых мутагенов, таких как:
- Азотистая кислота (HNO2),- Гидроксиламин (NH2OH),- Аналоги азотистых оснований. Они очень сходны по строению с нормальными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями и, поглощаясь клетками, способны включаться в ДНК. Часто для выделения мутантов используют 5-бромурацил (сходен с Тимином) и 2-аминопурин (сходен с Аденином). При переходе в енольную форму эти аналоги азотистых оснований неправильно спариваются.- Алкилирующие агенты,- Акридиновые красители (например, акридиновый оранжевый, акрифлавин),- УФ-лучи Мобильные генетические элементы бактерий.В качестве мутагенных факторов биологической природы рассматривают мобильные (=мигрирующие) генетические элементы бактерий – дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или фагового) в другой. К таким элементам относятся: простые вставочные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы) и фагитранспозоны (Mu, Д3112 и др.).
Различают несколько типов IS-элементов: IS1, IS2, IS3, IS4 и др. Они отличаются друг от друга по длине и структурой концевых повторов.Транспозоны – сложные мигрирующие элементы. Обозначаются как Tn 1, Tn 2,… Tn100, Tn 1002 и т.д.Частота миграции транспозонов и IS-элементов происходит с вероятностью 10–4–10–7 на одно деление бактериальной клетки. Она может зависеть от характера донорного и реципиентного репликонов; от генома клетки-хозяина; от факторов внешней среды (температура, УФ-лучи, химические соединения и др.).Бактериофаг Mu относится к умеренным бактериофагам. Геном фага Mu (линейная двуспиральная ДНК – 38 т. п. н.) также, как IS-элементы, имеет на концах инвертированные повторы, но только всего из двух нуклеотидных пар: 5′ ТГ ……………… ЦА 3′О