Тема 2. Методы исследования. Достижения в области биологии индивидуального развития

Поразительные успехи, достигнутые в наши дни молекулярной биологией дали новый толчок к развитию особого раздела эмбриологии, названного биохимической эмбриологией. Но наиболее ярко синтетическая направленность современной науки проявилась в установлении тесных связей между эмбриологией и генетикой. Долгое время эти две отрасли биологии развивались независимо, хотя они изучали разные стороны одних и тех же явлений: генетика – процессы передачи наследственных свойств, эмбриология – процессы осуществления этих свойств в ходе развития. Лишь в наше время, благодаря успехам в познании механизмов действия генов, возникла возможность их плодотворного объединения.

Тератология – это раздел эмбриологии, занимающийся изучением нарушений или пороков развития. Рисунки, изображающие особей с различными аномалиями, относятся к числу самых древних из зарегистрированных биологических сообщений. В далеком прошлом рождение «монстра» считалось предзнаменованием каких-то событий. Слово это происходит от латинского глагола monster – показывать, указывать. В Средние Века исследования по тератологии выродились и превратились в состязания, в котором люди старались перещеголять друг друга в сборе причудливых аномалий. В последнее время исследования по тератологии приняли совершенно новое направление. Сейчас, когда в странах с высоким уровнем медицинского обслуживания населения, врожденные аномалии развития вышли на одно из первых мест среди 10 причин смертности; прилагается много усилий и расходуется много средств на выявление и устранение факторов, обуславливающих эти аномалии. Изучаются механизмы, посредством которых тератогены (вещества, обуславливающие дефекты развития) нарушают нормальное развитие; и это изучение приобретает все более биохимическое и фармакологическое направление.

В последние годы наблюдается крайне быстрый рост исследований, относящихся к проблемам зачатия и применения противозачаточных средств. Это привело к возникновению новой дисциплины, которую обычно называют биологией размножения. Помимо проблем, главным образом, практического характера, касающихся методов оплодотворения и применения противозачаточных средств, эта дисциплина уделяет внимание нормальному гаметогенезу, эндокринологии размножения, переносу гамет и оплодотворению, ранним стадиям зародышевого развития и имплантации зародыша млекопитающих и человека.

В настоящее время широко распространен подход к эмбриональному развитию, известный под названием биология развития. Это очень обширная дисциплина, в которую входит не только изучение развития зародыша, но также изучение постнатальных процессов, таких, как нормальный и злокачественный рост, метаморфоз, регенерация и заживление тканей, исследуемых на всех уровнях – от молекулярного до организменного.

МЕТОДЫ изучения

Для изучения различных аспектов эмбрионального развития было предложено много различных методов: от исследования целых зародышей невооруженным глазом или при помощи простой лупы до чрезвычайно сложного молекулярно-биологического анализа. Все эти методы находят свое применение и важно помнить, что выбор метода зависит от изучаемого вопроса.

1.Непосредственное наблюдение за живыми зародышами.

Они осуществлялись либо невооруженным глазом, либо с помощью простой лупы. Создание микроскопа дало возможность исследовать гаметы и мелкие зародыши более подробно. Непосредственное изучение, особенно живого зародыша, дает представление о его общем облике и поражает наблюдателя видом тех динамических и зачастую очень быстрых изменений, из которых слагается зародышевое развитие. Главный недостаток прямого наблюдения состоит в том, что при этом не удается достаточно хорошо рассмотреть мелкие детали. Иногда этот недостаток удается преодолеть, применяя витальные красители, позволяющие идентифицировать определенные клетки и группы их и проследить за ними. Мощным средством для изучения зародышей в целом или групп клеток служит микрокиносъемка.

2.Изучение фиксированного материала.

Иногда у исследователя возникает желание остановить тот или иной процесс в критической фазе, с тем, чтобы более тщательно изучить материал. Это достигается путем фиксации, когда зародыш обрабатывается химическими реактивами (формалин, или глутаральдегидом), что дает возможность хорошо сохранить разные структуры, не создавая нежелательных искажений. Примерно сто лет назад фиксированные материал стали использовать для получения серийных срезов зародышей с целью их микроскопического изучения. Из таких срезов путем реконструкции можно построить трехмерную модель зародыша. Новые перспективы в исследовании зародышей открылись после того, как для анализа живых систем стали использовать сканирующий электронный микроскоп. С его помощью можно получить трехмерное изображение зародыша в целом или отдельных его частей, при чем по своей ясности и четкости эти изображения оставляют далеко позади все то, что позволяют другие методы.

3.Гистохимические методы.

Гистохимия – это метод, позволяющий установить локализацию определенных химических веществ или химических процессов в определенных морфологических структурах.

4.Радиоавтография.

Один из полезных побочных продуктов атомного века – возможность использовать радиоактивные изотопы в медико-биологических исследованиях. В биологические системы можно ввести предшественника макромолекул, содержащие меченные атомы, а затем при помощи различных аналитических методов проследить их судьбу в метаболическом цикле. Один из таких методов и называется радиоавтография. Он позволяет установить локализацию того или иного радиоактивного изотопа в клетках или тканях с помощью приёмов, сходных с теми, которые используют в фотографии. Этот метод оказался очень полезным для выявления миграций клеток и мест синтеза нуклеиновых кислот и белков в тканях зародыша и для прослеживания за перемещением клеток. Однако этот метод не позволяет определить в какой химической форме белки или нуклеиновые кислоты присутствуют в тканях.

5. Метод маркировки.

Для прослеживания за перемещением клеток в развивающемся зародыше используют разного рода маркеры. Некоторые классические работы по этому вопросу были выполнены с использованием нетоксичных маркеров, которыми метили небольшие группы клеток. Например, определенные красители, в частности сульфат нильского голубого или нейтральный красный, можно наносить на те или иные участки живого зародыша, причем не причиняя ему вреда. Такие красители называются витальными. Для маркировки можно использовать также мельчайшие частицы инертного древесного угля.

6. Методы микрохирургии.

Большая часть основных сведений о причинных механизмах, участвующих в зародышевом развитии, в частности тех, которые связаны с взаимодействием тканей, были получены с помощью методов микрохирургии. Для работы с зародышами, длина которых не превышает несколько миллиметров, пришлось создать специальные инструменты: стеклянные или вольфрамовые иглы вместо скальпелей и петли из детских волос вместо пинцетов, применяемых в обычной хирургии. При работе с очень мелкими объектами или группами клеток инструменты находятся не в руках исследователя, а у микроманипулятора. К методам микрохирургии относят удаление частей зародыша, с тем чтобы определить те последствия которые произойдут из-за отсутствия данной структуры для дальнейшего развития зародыша. Чрезвычайно интересен способ разрушения отдельных частей клеток или тканей с помощью тонкого лазерного луча. Широко также применяются такие хирургические методы как трансплантация и эксплантация.

Применение в клинике метода пересадки зародыша сделало возможным рождение человека in vitro. Впервые произошло это в Англии. У женщины, не способной иметь детей из-за непроходимости фаллопиевых труб, препятствие для овулированных яиц в матку, двое английских биологов Роберт Эдвардс и Патрик Стептоу извлекли яйцо из яичника и оплодотворили его in vitro спермой её мужа. По достижении зародышем стадии 8 бластомеров его имплантировали в стенку матки. Беременность прошла без осложнений и родился младенец женского пола.

7. Методы культуры на искусственных средах.

В зависимости от природы эксплантируемого материала такие методы носят название культуры клеток, тканей, органов или даже культуры целых зародышей. Методы культивирования различных объектов слегка различны в деталях, но в основе всех этих методов лежит один и тот же принцип. Материал, взятый от зародыша, помещают в стеклянные или пластиковые чашки или пробирки, в которых содержится культурная среда, близкая по составу к естественной среде зародыша, однако, к ней добавляют необходимые биологические факторы, такие как сыворотка или даже экстракты из целых зародышей. состав этих добавок точно не известен, но они содержат необходимые ростовые факторы. Метод культуры тканей был предложен Россом Г. Харрисоном, который совершил переворот в биологических исследованиях.

Одно из главных преимуществ методов культуры тканей состоит в возможности изменять определенным образом среду и саму ткань, что нельзя сделать in vivo. Недостаток же этих методов, особенно в случае клеточных и тканевых культур, заключается в том, что иногда бывает трудно решить, являются ли процессы, происходящие в культурных условиях, артефактами или процессами, имеющими место в самом зародыше.