Тема 6. Оплодотворение

Прежде, чем мы с вами начнем разговор об оплодотворении, поговорим и процессе осеменения. Совокупность явлений, благодаря которым происходит контакт между женской и мужской половыми клетками, называется осеменением. У разных организмов и у разных половых клеток мы наблюдаем разнообразные приспособления, обеспечивающие этот процесс. Различают наружное и внутреннее осеменение. В первом случае сперматозоиды и яйца выделяются во внешнюю среду, например, у водных животных. При внутреннем осеменении, благодаря копулятивным органам и согласованному действию самца и самки, сперматозоиды вводятся в половые пути самки.

Для некоторых пиявок характерно кожное осеменение, при котором сперматозоиды прикрепляются к гиподерме тела на спинной стороне, а затем они проникают сквозь клетки гиподермы в полость тела, а затем в матку сквозь её стенки. У саламандр, при сложном поведении самца и самки, откладывается сперматофор (мешочек со сперматозоидами). Самка помещает его в свою матку, где впоследствии спермии освобождаются и оплодотворяют яйцеклетки. При гермафродитизме (когда у одного и того же индивидуума имеются и яичники и семенники), в редких случаях происходит самоосеменение (например, у паразитических ленточных червей). Чаще всего происходит осеменение одной особи другой (например, у дождевых червей). У некоторых гермафродитов развитие и функционирование семенников и яичников происходит в разное время, поэтому одна и та же особь при коопуляции (совокуплении) оказывается то самцом, то самкой. Несмотря на то, что процессы осеменения являются объектом многочисленных зоологических и физиологических исследований, во многих случаях, однако, изучены недостаточно.

При наружном осеменении у многих беспозвоночных водных животных (актинии, иглокожии), яйца и спермии выбрасываются в воду лишь тогда, когда самец и самка приближаются друг к другу. Это несомненно зависит от каких-то химических веществ, которые они продуцируют, и особым рецепторам, которые свойственны самцу и самке. У больше, чем 40 видов актиний, моллюсков, немертин и других животных обнаружено, что сначала самец отдаёт сперму, а уж затем, возбужденная «спермовой жидкостью» самка выбрасывает яйца.

Вслед за осеменением следую процессы оплодотворения. Оплодотворением называется слияние сперматозоида с яйцеклеткой, завершающиеся объединением их ядер в единое ядро оплодотворенного яйца – зиготы. Сперматозоид при этом выполняет 2 функции: 1) активация яйца, побуждение его к началу развития. Эта функция не специфична для спермия; в качестве активирующего фактора он может быть заменен рядом физических, химических или механических агентов; 2) внесение в яйцеклетку генетического материала отца, здесь он уже не заменим.

Для оплодотворения яйца требуется 1 сперматозоид. Это явление называется моноспермия. Но ещё в прошлом столетии были известны случаи полиспермии. По данным С.Рюкерта (1890), при оплодотворении яиц голубя в цитоплазму проникают 15-25 сперматозоидов. Доказано, что при моноспермии, проникновение в яйцо «лишних» сперматозоидов вызывает уродства в развитии. Так, если в яйцо лягушки проникает несколько сперматозоидов, то с его ядром сливается, однако, ядро только одного сперматозоида. Привнесенные с другими спермиями центросомы образуют также центры дробления, вследствие чего, вместо нормального первого дробления, яйцо уродливо дробится сразу на несколько бластомеров. Развивающийся зародыш оказывается нежизнеспособным. Большинство эмбриологов убеждены, что для многих животных полиспермия вредна, и в норме, после проникновения одного сперматозоида, возникает «барьер» против проникновения других сперматозоидов, изменяются поверхностные слои цитоплазмы и образуется оболочка оплодотворения. Для некоторых животных, безусловно, полиспермия установлена как закономерное явление: у некоторых членистоногих (насекомые и паукообразные), брюхоногих моллюсков, хордовых (акулообразные и химеровые рыбы), хвостатых амфибий, рептилий, птиц.

Возникает вопрос: имеется ли корреляция между типом оплодотворения и строением оболочек яиц?

По мнению Гинзбург (1967) корреляции нет: полиспермия наблюдается как у яиц с оболочками, не проницаемыми для спермиев, так и у яиц, оболочки которых легко преодолеваются спермиями; в то же самое время моноспермия имеет место у таких животных, яйцеклетки которых проницаемы для сперматозоидов в любой точки поверхности яйца (иглокожие, млекопитающие и др.).

В ходе процесса оплодотворения половые клетки взаимодействуют друг с другом. Это взаимодействие можно разделить на 3 фазы:

1. дистантные взаимодействия, осуществляющиеся на некотором расстоянии, до соприкосновения гамет;

2. контактные взаимодействия, происходящие при непосредственном соприкосновении поверхностей гамет;

3. процессы, протекающие после вхождения сперматозоида в яйцо.

1. Дистантные взаимодействия. Давно уже эмбриологи отмечали влияние каких-то химических веществ, выделяемых яйцом, на находящиеся вблизи от него сперматозоидов. Ф.Р.Лилли (1921) убедился в том, что морская вода, в которой оказывались зрелые яйцевые клетки морского ежа, может вызвать усиление подвижности спермиев и их последующую агглютинацию. Вероятно, те же химические вещества влияют возбуждающе на самцов и вызывают нерест. Такие свойства «яичной воды» описаны не только для ежей, но и для многих других животных (морских звезд, моллюсков, круглоротых, рыб, амфибий). Имеются данные о хемотаксическом «притягивающим» влиянии «яичной воды» на сперматозоиды.

Продуцируемые яйцами специфические вещества, без которых невозможно оплодотворение, Ф.Р.Лилли назвал фертилизинами. Эти вещества присутствуют на поверхности яйца, а могут также находиться в яйцевых оболочках. Считают, что фертилизины – это гликопротеин или мукополисахарид. Как протеин он содержит аминокислоты, а как полисахарид – имеет молекулы одного или более моносахаридов – глюкозу, фруктозу или галактозу. И аминокислоты и моносахариды неодинаковы у разных видов животных, следовательно, различны и фертилизины. Молекулярная масса одного из фертилизина – 300000. Одновременно предполагается, что в поверхностных слоях цитоплазмы сперматозоида также содержатся особые вещества – антифертилизины. Это кислые протеины с молекулярной массой – 10000. А.Тайлер (1958) рассматривает систему фертилизин-антифертилизин как систему антиген-антитело; и считает, что они подходят друг к другу, как это принято говорить образно в иммунохимии, как «ключ» к «замку».

Гипотетические вещества, продуцируемые яйцами и спермиями, или содержащиеся в поверхностных слоях цитоплазмы, по инициативе М.Гертмана (1940), многие эмбриологи называют гамонами (гармонами гамет). Причем, гиногамон (гармон яйцеклетки) вырабатывается яйцеклеткой; андрогамон (гармон сперматозоида) вырабатывается мужской половой клеткой.

Яйцо содержит гиногамон 1 (низкомолекулярное вещество, небелковой природы, выделяемое яйцевыми оболочками), , активизирующий движение сперматозоидов и повышающий вероятность их встречи с яйцеклеткой; гиногамон 2, или фертилизин (изоагглютинины, видоспецифические вещества белковой природы, по-видимому, глюкопротеиды, вызывающие склеивание спермиев), агглютинирующий сперматозоиды. Биологический смысл этой реакции агглютинации спермиев состоит, по-видимому, предохранении яйцеклетки от проникновения в ней избыточных сперматозоидов.

Сперматозоид содержит также не менее 2-х андрогамонов: андрогамон 1 (вещество небелковой природы, представляющее антагониста гиногамона 1), т.е. парализует подвижность сперматозоидов; андрогамон 2 (он локализован в акросоме спрематозоида) растворяет оболочки яйца. Это скорее всего спермолизины, относящиеся к протеолитическим ферментам.

У спермиев млекопитающих андрогамон 2 называют нередко лизином и отождествляют его с энзимом гиалуронидазой, несомненно играющей роль важную в оплодотворении: этот энзим способен разжижать студенистые вещества. Предполагают, что гиалуронидаза может играть важную роль в проникновении спрематозоидов между клетками фолликулярного эпителия, который у яиц некоторых млекопитающих оказывается сильно развитым на поверхности зрелого яйца. Достаточная концентрация гиалуронидазы поддерживается благодаря большому количеству сперматозоидов в половых путях самки; а также благодаря тому, что стенки яйцеводов также способны её выделять.

В опытах на кроликах доказано, что оплодотворение не происходит, если при осеменении самке вносится менее 1000 сперматозоидов. Но оно не может состояться и в том случае, если в половых путях самки оказывается избыточное количество сперматозоидов (более 100 млн.). это объясняется в первом случае недостатком гиалуронидазы; во втором – её избытком.

2 стадия – контактные взаимодействия. Само это понятие предполагает наличие каких-то поверхностных структур на половых клетках. Именно поэтому в новейших исследованиях все большее внимание привлекает изучение характеристик поверхности взаимодействующих гамет. Так, у асцидий на поверхности яйцеклетки выделены участки, ответственные за «узнавание» нужных спермиев. Это, как выяснилось, происходит благодаря наличию специальных гликопротеиновых молекул в оболочке яйца – рецепторы, с которыми взаимодействуют поверхностные молекулы головки спермия.

Свойства поверхности яйца, благодаря которым происходит взаимодействие со сперматозоидом, проявляются в процессе созревания и оплодотворения. Вначале 2 мейотического деления в плазматической мембране яйца возникают рецепторные зоны, ответственные за узнавание поверхности спермия. После отделения 2-го направительного тельца, эти зоны концентрируются в районе анимального полюса. В этом процессе принимают участие и микротрубочки. Сформированные яйцевые клетки имеют разнообразные поверхностно расположенные структуры, через которые сперматозоид проникает при оплодотворении. К ним прежде всего относятся оболочки, которые есть у всех яйцеклеток, за редким исключением.

Возникает вопрос: как происходит проникновение сперматозоидов через эти оболочки? Во-первых, у некоторых яиц проникновение сперматозоидов происходит только через особое «отверстие» микропиле - маленький участок первичной или вторичной оболочки, где не произошло формирование структуры, обычной всей поверхности. Чаще всего это тот участок поверхности ооцита через который происходит приток питательных веществ. С прекращением питания на завершающих стадиях роста ооцита одна из клеток фолликула остается в тесном соединении с поверхностью и отмирает после полного сформирования яйца. Однако микропиле не представляет из себя полого канала, а является также «барьером», который необходимо преодолеть сперматозоиду. Во-вторых, методы фазово-контрастной и электронной микроскопии обнаружили, что и сперматозоидам присуща контактная реакция. Она получила название акросомной реакции. Её удалось выявить у сперматозоидов морских звезд, некоторых моллюсков, аннелид, круглоротых, осетровых рыб и других животных.

В эпоху, когда не было электронного микроскопа, предполагали, что головка сперматозоида обладает «прободающей» способностью, т.е. на конце головки спермия имеется перфораторий («прободатель»). Нет основания отрицать значение механического действия головки сперматозоида. Однако современные методы исследования позволили установить, что механизм проникновения сперматозоида в яйцо представляет сложную цепь морфологических и химических реакций. Итак, то, что считали перфораторием, на самом деле представляет у сперматозоидов многих животных сложное образование – акросомную область спермия. Эта область ограничена мембраной, которая изолирует акросомный пузырек от ядерной области. В центре пузырька находится округлое тело – акросомная гранула. Апикальный конец её доходит до вершины головки сперматозоида.

При соприкосновении с яйцом или «яичной водой» сперматозоид претерпевает изменения. Оболочка акросомы разрушается и выбрасывается тонкая упругая акросомная нить. У сперматозоидов морских ежей она всего лишь около 1 мкм длиной, у морских звезд – до 25 мкм, у осетра – 5-8 мкм. С помощью электронной микроскопии удалось выявить ту структуру акросомного аппарата, которая в первую очередь реагирует на близость яйца или его оболочек, воспринимает воздействие, вызывающие акросомную реакцию. Это – тончайший слой плотного материала, лежащего непосредственно под плазматической мембраной в апикальной части спермиев.

Акросомная нить, возникающая у сперматозоидов ещё до контакта его с яйцом, проникает через студенистую оболочку яйца, а затем и через желточную. В связи с этим образуется «конус» оплодотворения, форма которого может меняться от довольно правильного конуса, расположенного вокруг акросомной нити, до псевдоподиеподобных выростов. По мере проникновения головки сперматозоида акросомная нить постепенно исчезает. Далеко не у всех животных сперматозоиды имеют такой акросомный аппарат с акросомными нитями. Их может и не быть. Особенности организации спермиев связаны со строением оболочек яйца, в частности, с наличием или отсутствием микропиле.

При изучении оплодотворнеия у млекопитающих найдено, что акросома кроме гиалуронидазы содержит протеолитические ферменты типа трипсин, способные разрушать фолликулярные клетки и блестящую оболочку. А.Тайлер (1959) представляет процесс оплодотворения как пиноцитоз, под которым подразумевается поглощение клеткой жидких веществ из внешней среды. Подобные представления возникали ещё в начале 20 века. Действительно некоторое сходство этих есть, но схема Тайлер приходит в противоречие с данными электронной микроскопии и цитохимии.

Для побуждения яйца к развитию и для оплодотворения не требуется проникновение всего сперматозоида. Нередко хвостовая часть его остается вне яйца. Эксперименты показывают, что для активации яйца к развитию не обязательно проникновение в яйцо спермия. Требуется лишь «пусковой механизм», возникающий при начальных процессах взаимодействия спермия с яйцом. Многочисленные наблюдения говорят в пользу важной роли процессов, совершающиеся при оплодотворении в кортикальных (поверхностных) структурах яйца.

Таким образом, венцом контактных взаимодействий гамет является проникновение спермия в яйцо, изменения в поверхностных слоях яйца и образование оболочки оплодотворения. Ранее мы отмечали её большую роль в предотвращении полиспермии, если в норме – моноспермия у животных. Механизм предотвращения полиспермии изучался многими, согласно их данным имеет место двухфазное блокирование полиспермии:

1 – протекает первые 1-2 сек. После установления контакта между оплодотворяющим спермием и яйцом, на поверхности яйца распространяются невидимые изменения, которые делают его менее доступным для других спермиев;

2 - затем наступает полное блокирование, т.е. происходят видимые изменения кортикального слоя яйца, после завершения которых яйцо становится полностью непроницаемым для сперматозоидов.

3 фаза – процессы, протекающие после вхождения сперматозоида в яйцо. В связи с оплодотворением бурные процессы протекают не только в кортикальном слое; энергичные изменения происходят и в состоянии яйца. Например, у яиц амфибий, на стороне, противоположной месту вхождения сперматозоида, в области экватора происходят видимые изменения в пигментации: пигмент отступает внутрь и эта часть яйца становится более светлой, представляя серый серп или серый полумесяц. Очевидно, что такие изменения и преобразования не могли бы наступить без специфических биохимических процессов, без перемещения цитоплазмы, вызванного проникновением сперматозоида. При оплодотворении изменяется состояние всего яйца. Процессы эти изучены недостаточно, даже у таких излюбленных эмбриологами объектов, как амфибии. Так, имеют ещё место споры и о механизме образования «серого серпа».

О больших физико-химических изменениях, происходящих во всем яйце, свидетельствуют кроме того и передвижения в цитоплазме яйца как собственного ядра, так и проникшего сперматозоида, точнее его головки и шейки. При вхождении спермия впереди оказывается головка, а затем шейка, где локализована центросома. Близлежащая цитоплазма яйца изменяется, возникают лучи уплотненной цитоплазмы, в связи с чем головка сперматозоида перемещается так, что впереди оказывается центросома. Вместе с движением головки сперматозоида, движется и ядро яйцеклетки. Нельзя думать, что движения эти хаотичны. Наоборот, можно говорить о закономерной «тропе оплодотворения». По мере движения ядер навстречу друг к другу происходит изменения их организации. Наиболее характерным признаком при преобразовании ядер в пронуклеусы считается начало репликации в них ДНК. В конце концов оба пронуклеуса приходят в соприкосновение, и наступает их соединение, но при этом слияние женского и мужского ядер (их хромосом) не происходит. Это явление называется сингамия. А состояние ядер называется синкарион.

Можно отметить целую серию биохимических изменений, происходящих в яйце в связи с оплодотворением. Несмотря на то, что зрелая яйцеклетка имеет необходимые аппараты для синтеза белков, многочисленные исследования показывают, что синтез белка в ней не происходит. Причины этого не ясны, но предполагают наличие в яйце каких-то ингибиторов (тормозящих веществ) и отсутствие необходимых связей и сочетаний между компонентами белоксинтезирующего аппарата. Лишь при оплодотворении начинается незамедлительно интенсивный синтез белка. Таким образом, мы приходим к заключению, что оплодотворение яйца – это начало работы всего аппарата, от которого зависит синтез белка, начало функционирования нового ядра, о чем свидетельствует синтез новых И-РНК.

Партеногенез (девственное развитие). Мы уже с вами говорили о том, что активация яйца к развитию может происходить и без участия сперматозоида. У некоторых животных развитие яиц без оплодотворения происходит строго закономерно и называется естественным партеногенезом ( от греч. рarthenos – девственница, genea – развитие). Партеногенез распространен среди насекомых (тлей), низших ракообразных, коловраток, встречается у моллюсков и других животных. У коловраток в течении лета из отложенных яиц развиваются только поколения самок, которые в свою очередь , несколько раз откладывают летние яйца, развивающиеся без оплодотворения. В последних партеногенетических поколениях появляются самцы и самки, откладывающие зимние, оплодотворенные яйца.

Своеобразное явление так называемый факультативный партеногенез, который имеет место у пчел, ос и муравьев. После осеменения в семяприёмнике царицы оказывается много сперматозоидов. Семяприёмник устроен так, что самка как бы по произволу может откладывать оплодотворенные или неоплодотворенные яйца. Оплодотворенные яйца развиваются в личинки самок, или рабочих пчел или цариц, а неоплодотворенные – в личинки самцов, или трутней.

Естественный партеногенез происходит и у некоторых животных (например, у сосальщиков), которые размножаются уже на личиночных стадиях развития, такой партеногенез называется педогенезом.

В связи с партеногенезом возникают 2 вопроса: 1- генетико-эмбриологический и 2 - чисто эмбриологический.

Первый вопрос – каков набор хромосом у соматических клеток партеногенетически развивающихся животных? У пчел и ос оказывается гаплоидный набор хромосом (гаплоидный партеногенез). В соматических клетках других развивающихся партеногенетическим путем животных (тлей, коловраток, ракообразных) оказывается диплоидный набор хромосом (диплоидный партеногенез).

Второй вопрос – каков механизм естественного партеногенеза? Сравним ли он с процессами, происходящими при оплодотворении? К сожалению эмбриология ещё не располагает достаточными данными, чтобы ответить на этот вопрос. Предполагается, что какие-то факторы внешней среды (а в случаях, подобных факультативному партеногенезу у пчел, какие-то эндогенные факторы) играют роль сперматозоидов, обеспечивая «пусковой механизм» активации яйца.

Для более полного понимания механизма активации яйца сперматозоидом или естественными партеногенетическими агентами большое значение приобрели опыты по искусственному партеногенезу, начатые ещё в прошлом столетии. Это и опыты А.А.Тихомирова (1886) на яйцах тутового шелкопряда, которые он активировал концентрированной серной кислотой; и опыты Б.Л.Астаурова, который разработал промышленный способ стимулирования развития неоплодотворенных яиц тутового шелкопряда, используя методы обработки их высокой температурой и другие. О. и Р. Гертвиги сообщили о возможности партеногенетического развития яиц морских ежей после обработки их хлороформом и стрихнином. Большой интерес вызвали опыты Е.Батайяна. Он вызвал партеногенетическое развитие яиц лягушек и жаб уколом иглы.

Создается впечатление полной неспецифичности партеногенетических агентов. Но это не верно, так как, во-первых далеко не всякое вещество и физический агент может вызвать активацию яйца; во-вторых партеногенез может вызываться как общими агентами, так и специфическими для данного вида животного. В то же время поражает разнообразие разнообразие испытанных агентов. Но что их объединяет это то, что все они поражают кортикальный слой яйца подобно тому как это происходит при оплодотворении. Таким образом данные по искусственному партеногенезу подтверждают гипотезы о важнейшей роли в оплодотворении кортикальных изменений в яйцевых клетках.

Проблема партеногенеза ждет новых исследователей, так как представляет большой теоретический интерес и не безразлична для практики.