2.Геномика микроорганизмов. Виды генетической рекомбинации.

У прокариот, у которых отсутствует мейоз, генетическая рекомбинация сопряжена с такими естественными формами обмена и переноса генетического материала, как:

Конъюгация – передача генетической информации с помощью плазмид путем непосредственного контакта бактерии-донора и бактерии-реципиента. Встреча клеток происходит случайно, образуется контакт с помощью пилей, в них формируется конъюгационный мостик. Происходит разрезание одной цепи плазмиды, ее перенос в другую клетку. Если контакт длится достаточно долго, то в клетку переносится вся цепь плазмиды. Затем обе цепи реплицируется. В случае более кратковременного контакта переносится только часть плазмиды. Еще одним вариантом может быть встраивание части цепочки плазмиды в хромосому бактерии или даже перетягивание цепочки НК хромосомы в другую клетку, затем происходит кроссинговер участков хромосом и их репликация. Вторая хромосома далее существует в виде гигантской плазмиды. Открыта Ледербергом в 1946.

Трансформация – перенос генетической информации в виде свободной ДНК. Может быть спонтанной или индуцированной. Перед процессом клетки переходят в компетентное физиологическое состояние (обработка электричеством повышает эффективность трансформации). В 1928году Гриффит экспериментировал со штаммами Streptococcus pneumonia. S-форма капсульного стрептококка вирулентна, а R-форма – нет. Он заразил мышей R-формой, а затем ввел убитую S-форму. В результате мыши умерли, а из них был получен вирулентный капсульный S-штамм.

Трансдукция - передача генетической информации с помощьювируса. Открыт Зингером и Ледербергом в 1952. Общая трансдукция – фрагменты бактериальной ДНК случайно включаются в фаговую ДНК или даже вместо нее. Ограниченная – процесс рекомбинации между фаговой ДНК и ДНК бактериальной клетки. Абортивная – трансдуцируемый фрагмент ДНК не включается в хромосому клетки=хозяина, остается в цитоплазме и проявляется фенотипически. Взаимодействие с клеткой хозяина:

вирусы могут проходит литический цикл – продуктивная инфекция, или лизогенный цикл – встраивание в хромосому хозяина (могут передаваться по наследству).

У вирусов генетическая рекомбинация происходит при заражении ими клеток. После лизиса клетки обнаруживаются вирусы с рекомбинантными ДНК.

3.Аммонификаторы.

Аммонификаторы - физиологическая группа бактерий, использующих белки и аминокислоты в качестве энергетических субстратов, что сопровождается выделением в среду аммиака. Аммонификация – распад белков в почве, минерализация азота. Участвуют грибы и бактерии (Bacillus cereus, Proteus vulgaris, Pseudomonas, Micrococcus). Сначала может идти декарбоксилирование (в результате образуется углекислый газ и первичные амины – кадаверин и путресцин) или дезаминирование (с выделением аммиака). Окислительное дезаминирование – глутаминовая кислота до 2-оксоглутаровой кислоты. Гидролитическое дезаминирование – гидролиз мочевины.

Группа почвенных микроорганизмов, являющихся гнилостными бактериями и вызывающих гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины. Аммонификация – микробиологическая трансформация азота органических соединений (главным образом аминокислот) в ион аммония или аммиак. Разложение органического вещества протекает в аэробных условиях и сопровождается активным образованием CO2. В процессе гниения участвуют аэробные бактерии – B. subtilis, B. mesentericus, Serratia marcescens, бактерии рода Proteus; грибы рода Aspergillus, Mucor, Penicillium; анаэробы – C. sporogenes, C. putrificum; уробактерии – Urobacillus pasteuri, Sarcina ureae, расщепляющие мочевину.

Билет 19

1. Генетические и негенетические взаимодействия между вирусами

Моноинфекций почти не существует. Вирусы репродуцируются в условиях смешанной инфекции.

Генетические:

1)Множественная реактивация. Вирусная инфекция может возникнуть при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденными геномами вследствие того, что функцию поврежденного гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден. Этот феномен был вначале обнаружен на бактериофагах и получил название множественной реактивации. В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс, при котором вирионы с поражением разных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате чего репродуцируется исходный неповрежденный вирус.

2) Генетической рекомбинацией называют обмен генетическим материалом, происходящий между родительскими вирусами. Возможен обмен полными генами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). Образующийся вирус-рекомбинант обладает свойствами, унаследованными от разных родителей. Обычно рекомбинируемые штаммы обладают характерными признаками, которые обозначаются как маркеры. Для получения рекомбинантов используют штаммы, содержащие два или большее число маркеров.

3) Пересортировка генов. Она наблюдается при генетических взаимодействиях между вирусами, имеющими сегментированный геном. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты. Существуют определенные группировки генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.

4) Перекрестная реактивация, кросс-реактивация или реактивация при скрещивании, происходит в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном интактен. При смешанной инфекции двумя такими вирусами возможна рекомбинация неповрежденных участков генома инактивированного вируса с геномом интактного вируса, и в результате этого процесса появляются штаммы вируса со свойствами обоих родителей. Описываемый феномен также обозначается как «спасение маркера», поскольку реактивируется (рекомбинирует) лишь часть генома инактивированного вируса, несущая какой-нибудь признак (маркер).

5)Гетерозиготность. При совместном культивировании двух штаммов вируса может происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или по крайней мере один полный геном и часть второго генома.

НЕгенетические:

1) Комплементация (дополнение) является таким видом негенетического взаимодействия при смешанной инфекции двумя вирусами, которое стимулирует репродукцию обоих партнеров или одного из них, но не изменяет генотипы вирусов. Принцип комплементации заключается в том, что вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными.

2) При совместном культивировании двух вирусов может наблюдаться феномен фенотипического смешивания, когда геном одного вируса бывает заключен в капсид, состоящий частично или полностью из белков другого вируса. Легко преодолевают филогенетические барьеры и заражают неприродных хозяинов.

2. Разложение клетчатки, лигнина, пектинов м/о-ми (этого достаточно?? или нужны прям реакции? дополняйте, если что))

Ферментативное расщепление целлюлозы осуществляется под воздей­ствием целлюлазы. В условиях лабораторной культуры микроорганизмы обычно синте­зируют эти ферменты лишь в том случае, если целлюлоза-един­ственный имеющийся субстрат. Их синтез подавляют как другие суб­страты, так и продукт расщепления целлюлозы-целлобиоза.

Разложение целлюлозы в аэробных условиях. В хорошо аэрируемых почвах целлюлозу разлагают и используют аэробные микроорганизмы (грибы, миксобактерии и другие эубактерии), а в анаэробных усло­виях-в основном клостридии.

В аэробных условиях значительная роль в разложении целлюлозы принадлежит грибам. Cytophaga и Sporocytophaga- аэробные бактерии, разлагающие цел­люлозу.

В анаэробных усло­виях целлюлозу расщепляют чаще всего мезофильные и термофильные клостридии. Термофильный видClostridium thermocellum растет на про­стых синтетических средах, используя в качестве субстрата целлюлозу или целлобиозу, а в качестве источника азота-соли аммония; глюкозу и многие другие сахара эта бактерия не утилизирует. Продуктами сбра­живания целлюлозы являются этанол, уксусная, муравьиная и молочная кислоты, молекулярный водород и С0₂. Вне клеток целлюлоза расще­пляется, вероятно, только до целлобиозы. 

Целлюлозные микроорганизмы выполняют огромную санитарную роль, разлагая клетчатку отмерших растений, благодаря чему в почве накапливается гумус, повышающий ее плодородие.

3. Разложение пектиновых веществ

Пектины – это межклеточные вещества растительных тканей. Имеется

три типа пектиновых веществ: протопектин, пектин, пектиновая кислота,

которые подвергаются окислению или сбраживанию разнообразными

микроорганизмами.

Способность расщеплять пектин присуща многим грибам и бакте­риям. Патогенность различных микроорганизмов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. lycopersici) для растений зависит от выделения ими ферментов, растворяющих пектины. Erwinia carotovora вызывает распад тканей у салата, моркови, сельдерея и т. п. В почве численность мик­роорганизмов, разлагающих пектины, чрезвычайно велика (10⁵ клеток на 1 г почвы). 

При анаэробиозе они сбраживаются маслянокислыми бактериями

Clostridium pectinovorum, C. felsineum с образованием масляной кислоты,

уксусной кислоты, водорода, углекислого газа.

Организмы, разлагающие пектины, играют важную роль при мочке льна и конопли. Цель этого процесса-отделение пучков целлюлозных волокон от остальных растительных тканей. В аэробной росяной мочке участвуют грибы, а в анаэробной водяной-главным образом бактерии. 

Разложение лигнина. Некоторые грибы могут разрушать лигнин да­же в живых растениях. Разрушающие древесину базидиомицеты можно разделить на две группы. Возбудители бурой гнили превращают древе­сину в красновато-коричневую массу; они разрушают главным образом целлюлозные и гемицеллюлозные компоненты древесины и не дей­ствуют на фенилпропановые полимеры. Возбудители белой гнили разру­шают древесину с образованием почти белой массы; они действуют в первую очередь на лигнин и почти не затрагивают целлюлозу. К гри­бам, разрушающим прежде всего лигнин, относятся Polystictus versicolor и некоторые другие (например, Stereum hirsutum). Есть также грибы, дей­ствующие одновременно на лигнин и целлюлозу; таковы Pleurotus ostreatus, Ganoderma applanatum, Polyporus adustus, Armillaria mellea.Раз­рушение древесины чистыми культурами грибов происходит так мед­ленно, что эксперименты растягиваются на месяцы и даже годы. С по­мощью различных методов удалось выявить способность к разложению лигнина также у представителей некоторых других родов (Pholiota,Clitocybe, Lenzites, Panus, Poria, Trametes и др.).

Выде­ленный лигнин или его производные (феноллигнин или лигнинсульфонаты) мо­гут служить единственным источником углерода не только для грибов, перечис­ленных выше, но и для многих аскомицетов и несовершенных грибов. Можно получать также накопительные культуры некоторых штаммов бактерий (Flavobacterium, Agrobacterium иPseudomonas) на частично переваренных препара­тах лигнина. В смешанных культурах разложение лигнина происходит быстрее и полнее, чем в чистых.

3. Цитопатическое действие в-сов

Это способ наблюдения репродукции в-сов. В зараженной клетке возн-ют различные патологические изм-ия (в морфологии и физиологии).

Специфические (почерк вируса) – характерные изменения.

1.вакуолизация цитоплазмы

2.вирусные включения (кристаллы) Включения являются специфическим морфологическим признаком вирусной инфекции, имеют диагностическое значение. Выявляются вирусные включения в ядре или цитоплазме. Чаще всего это место размножения вируса или скопления вирусных частиц. Характерные ядерные включения образуют вирусы герпеса, полиомиелита, аденовирусы. Цитоплазматические включения формируются в клетках, зараженных вирусом оспы, гриппа, бешенства.

3.образование симпластов (в. гриппа) Некоторые вирусы вызывают характерный цитопатический эффект, проявляющийся в слиянии клеток и образовании многоядерных клеток – симпластов (синцитий)

4.бляшкообразный эффект (в монослое) – в-с вызывает гибель клеток, бляшки – пустоты. Размер бляшек зависит от вирулентности.

Неспецифические:

1.В рез-те механического повреждения разрушаются лизосомы, высвобождаются ферменты, которые вызывают аутолиз клетки. Эти высокоактивные ферменты выходят в кровь – лихорадка, повышение темп-ры. (Но сами вирусы токсинов не выделяют)

2.Мутагенное действие вирусов – выз. мутации даже в инактивированном состоянии.

Билет 20

1. Репродукция в-сов с РНК-геномами (подчистите так, как вам понятнее)

  Репликацию вирусных РНК-геномов в инфицированной клетке осуществляет вирус-специфическая РНК-зависимая РНК-полимераза. В случае вирусов растений и ряда бактериофагов она может быть организована как из вирусных, так и клеточных субъединиц. РНК-зависимая РНК-полимераза — это и транскриптаза и репликаза. Репликация и транскрипция вирусных РНК геномов — процессы взаимосвязанные. Переключение транскрипции на репликацию, как правило, определяется накоплением белковых продуктов трансляции мРНК, достаточных для морфогенеза вирусных частиц.          Репликация РНК происходит по принципу РНК-зависимого синтеза РНК и идет через образование промежуточных репликативных форм. 

Репликация однонитчатых РНК осуществляется в два этапа: вначале синтезируются комплементарные геному нити, которые в свою очередь становятся матрицами для синтеза копий генома. У «минус-нитевых» вирусов первый этап репликации — образование комплементарных нитей сходен с процессом транскрипции. Однако между ними есть существенное отличие: если при транскрипции считываются определенные участки генома, то при репли­кации считывается весь геном.  В то же время матрицы для репликации являются полной комплементарной последовательностью генома и называются антигеномом. В зараженных клетках существует механизм переклю­чения транскрипции на репликацию. У «минус-нитевых» вирусов этот механизм обусловлен маскировкой точек терминации транскрипции на матрице генома, в результате чего происходит сквозное считывание генома. Точки терминации маскируются одним из вирусных белков.

При репликации растущая «плюс-нить» вытесняет ранее синтезированную «плюс-нить» либо двухспиральная матри­ца консервируется (рис. 24). Более распространен первый механизм репликации.

Репликациция (-)РНК-геномов          Вирусные (-)РНК-геномы могут быть непрерывными или сегментированными. Во всех случаях РНК находится в составе рибонуклеопротеина, что и определяет особенности ее репликации, поскольку депротеинизированная РНК не может служить матрицей для полимеразы. Все вирусы с (-)РНК-геномом имеют собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу, входящую в состав РНП. Для получения полноразмерного генома должна быть синтезирована репликативная полноразмерная плюс-нить. Однако на первом этапе репродуктивного цикла геномная (-)РНК служит матрицей для транскрипции, которая протекает с последующим процессингом мРНК, и не может служить матрицей для синтеза полноразмерной копии. Синтез репликативной полноразмерной (+)РНК начинается только после накопления соответствующих вирусных белков, подавляющих преждевременную терминацию РНК на внутренних участках матрицы. Каким образом это происходит, остается пока неизвестным. Синтез антигеномной и геномной РНК происходит в составе РНП.          Репликациция днРНК реовирусов          Реовирусы — двукапсидные (60-75 нм) частицы с икосаэдрическим типом симметрии, инфицируют позвоночных, беспозвоночных, растения. Геном состоит из 10-12 фрагментов днРНК.          Репликация днРНК неразрывно связана с транскрипцией, которая является ее первой стадией.          1. Синтез (+)РНК на двухнитевой матрице протекает по консервативному типу без вытеснения цепи и происходит в составе однокапсидной вирусной частицы при участии белков кора — вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP2) и гуанидилтрансферазы (VP3). мРНК покидают частицу через поры внутреннего капсида.          2. Плюс-нити РНК объединяются с вновь синтезированными белками кора и неструктурными (NS) белками. При созревании вириона РНК-полимераза осуществляет синтез минус-нитей на матрице (+)РНК по репарационному механизму, затягивая ее внутрь формирующегося капсида. Сформированная однокапсидная частица может снова начать синтез плюс-нитей РНК.          Как и в случае полиовирусов, представленный способ репликации генома реовирусов не является универсальным для вирусов с днРНК геномом. Например, у фага φб синтез плюс-нитей на родительском дуплексе происходит по полуконсервативной модели и всегда сопряжен с вытеснением предшествующей нити (+)РНК.

2. Трансформация

Это Перенос генетической информации в бактериальные клетки при помощи изолированной ДНК с участием или без плазмид, но всегда без участия вирусов (см. Трансдукция). Способность клетки к восприятию экзогенной ДНК в процессе трансформации – компетентность.

-спонтанная – нарушаются гены, контролирующие продолжительность жизни (апоптоз)

-индуциованная.

Способы усиления трансформации: обработка электр. импульсами – электротрансформация и введение спец. в-в.

Трансформация была открыта в 1928 году, когда британский учёный Ф. Гриффит показал возможность превращения непатогенных штаммов Streptococcus pneumoniae в патогенные (различаются наличием полисахаридной капсулы, позволяющей закрепляться на тканях высших организмов) в результате взаимодействия с убитыми клетками патогенных штаммов. В 1944 году О. Эйвери (США) показал, что для передачи признака достаточно обработки ДНК патогенного штамма пневмококка. Это открытие стало первым свидетельством роли ДНК как носителя наследственности.

3. Культуры клеток. Приготовление, хранение, использование

см Билет 17 вопрос3

Способы хранения:

1)криоконсервация – в замороженном состоянии. Первичные культуры не выживают (только для дипл. и гетероплоидных) Нужна высокая концентрация клеток. Криопротектор (глицерин или диметилсульфоксид) . Замораживают в жидком азоте. Ампулы могут взрываться при разморозке.

2) Известен способ хранения культур клеток в жидком состоянии под давлением 400-500 атм с охлаждением до (-5) - (-6)^oC [прототип].

Однако этот способ не обеспечивает сохранности пространственной структурной организации клеточных ассоциаций и высокого уровня их жизнеспособности.