3)Фазово-контрастная микроскопия

При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз этих изменений заметить не может и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении невидимых фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

1) набора объективов со специальными фазовым пластинками;

2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

3) вспомогательного микроскопа.

Bacillus Cereus на плотной питательной среде (в камере М. А. Пешкова)

Настройка фазового контраста основном заключается в следующем: 1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквой Ф или ph) ; 2) устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой «0»); 3) настраивают свет по Келеру; 4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат; 5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму; 6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. За изобретение фазово-контрастной микроскопии его автор голландский физик Цернике был удостоен Нобелевской премии.

Билет №7

1. Архитектура вирионов. Самосборка

В 1955 году Френкель поместил в водную среду нужные белки и РНК и получил полноценные инфекционные вирионы ВТМ.

Вирионы формируются в соответствии со строгими математическими законами без каких-либо энергетических затрат.

Обязательным структурным компонентом вирусов является капсид – белковая оболочка, окружающая вирусную НК (просто устроенные вирусы - пикорнавирусы, парвовирусы). Сложно устроенные вирусы имеют еще дополнительную внешнюю оболочку – суперкапсид, состоящую из липидов и углеводов. В основе самосборки вирусов лежат несколько типов симметрии, по которым образуются сложные устойчивые пространственные структуры, обладающие минимальной свободной энергией.

1. Спиральная симметрия (палочковидные вирусы, нитевидные)- белковые субъединицы ассоциируются с геномом и образуют спиралевидную, винтообразную структуру. ВТМ, парамиксовирусы, рабдовирусы.

2. Кубическая симметрия (кубические вирусы) – белковые субъединицы образуют полое тело (симметричное в трех взаимно перпендикулярных направлениях - икосаэдр), внутри которого в центре находится геном. Более устойчивы, чем спиралевидные. Вирус полиомиелита.

3. Смешанная симметрия (бактериофаги) – сложно организованная структура, состоящая из головки (кубическая), шейки и отростка (по спиральному типу). Отросток состоит из белков, имеющих сократительную способность. Он располагается на шестигранной пластинке, у основания которой находится фермент – мурамидаза, разрушающий клеточные стенки бактерий. На пластинке также располагаются прикрепительные нити с антирецепторами, комплементарными рецепторам поверхности клетки хозяина. Вирус как бы впрыскивает свою НК в клетку хозяина, прикрепляясь к ней.

4. Оболочечные вирусы – имеют геном в кубическом капсиде, окруженный еще дополнительной оболочкой (цитоплазматическая мембрана из липидов клетки хозяина с встроенными в нее пепломерами. Пепломеры помогают вирусу прикрепляться, в состав может входить гемагглютинин – склеивает эритроциты или нейтраминидаза – обеспечивает проникновение вируса в клетку). Вирус гриппа и ВИЧ.