Литература:

1. Кабанова, А.А. Гнойно-воспалительные процессы челюстно-лицевой области и шеи. Современные подходы к диагностике, прогнозированию и лечению / А.А. Кабанова, И.О. Походенько-Чудакова // Военная медицина. – 2013. − № 3. – С. 125−129.

2. Особенности регионарной гемодинамики лица при лечении острых гнойных одонтогенных периоститов челюстей / С.Н. Федотов [и др.] // Стоматология. − 2010. − Т. 89, − № 5. − С. 48−51.

3. Походенько-Чудакова, И.О. Системный воспалительный ответ при одонтогенных гнойно-воспалительных процессах челюстно-лицевой области / И.О. Походенько-Чудакова, Ю.М. Казакова, А.А. Вербицкая // Современная стоматология. – 2011. − № 2 (53). – С. 75−76.

4. Odontogenic maxillary sinusitis with oro-nasal fistula: a case report / F. Carini [et al.] // Ann. Stomatol. (Roma). – 2014. – Vol. 25, № 5. – P. 37−39.

5. Review article: maxillofacial emergencies: oral pain and odontogenic infections / A.F. DeAngelis [et al.] // Emerg. Med. Australas. – 2014. – Vol. 26, № 4. – P. 336−342.

Оценка способности ферментов и антисептиков разрушать экзополимерный матрикс биопленки streptococcus oralis

Колчанова Н.Э.(аспирант), Шилин В.Е.(доцент, к.м.н.)

Руководитель: Окулич В.К.(доцент, к.м.н.)

УО «Витебский государственный медицинский университет»,

г. Витебск

Актуальность. Заболевания периодонта занимают одно из первых мест по частоте и распространенности среди стоматологических заболеваний. По данным ВОЗ, основанным на статистике 53 стран мира, в различных возрастных группах заболеваемость гингивитом и периодонтитом достигает 80-100% [3].

В последние годы появились публикации, касающиеся различных аспектов биопленки. Биопленка – микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов.

Биопленка состоит из смеси полисахаридов (декстран, гиалуроновая кислота, целлюлоза и др.) 40-95%, также содержит белки до 60%, липиды до 40%, нуклеиновых кислот 1-20%, вода 80-90%. Такая форма существования предоставляет бактериям массу преимуществ в условия воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и организма-хозяина. Микрофлора биопленки более устойчива к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы по сравнению со свободно плавающими бактериями; микроорганизмы, входящие в ее состав, оказались очень устойчивы к воздействию ультрафиолетового излучения, дегидратации, антибиотикам и факторам иммунной защиты [1].

Несмотря на очевидную актуальность, недостаточно известно о подборе методов эффективного воздействия на бактерии ротовой полости, находящиеся в составе биопленок. Таким образом, профилактика и борьба с колонизацией бактериями, способными вызывать заболевания периодонта, остается чрезвычайно актуальной [2].

Цель. Определить способность ферментов и антисептиков разрушать экзополимерный матрикс биопленки S.oralis.

Материалы и методы исследования. Нами было обследовано 50 пациентов на кафедре терапевтической стоматологии УО ВГМУ с диагнозом хронический генерализованный маргинальный периодонтит. У каждого из них проводился забор материала из периодонтального кармана в транспортные среды, транспортировка осуществлялась в течение 3 часов. Лабораторные исследования выполнены на кафедре клинической микробиологии УО ВГМУ. Идентификацию прошли только 18 проб, при этом 39% соответствует S.oralis.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программ Statistica 10, Excel. Так как изучаемые показатели имели нормальное распределение во всех группах исследования (р для критерия Шапиро-Уилка во всех группах >0,05), результаты представлены в виде М± σ (M-среднее значение, σ-стандартное отклонение).

Результаты исследования. Для оценки способности антисептиков и ферментов расщеплять экзополимерный матрикс биопленки использовали разработанный нами метод. В стерильную чашку Петри с агаром Мюллера – Хинтона помещали стерильную инертную полимерную мембрану, прижимали стеклянным грузом и вносили 0,5 мл взвеси S. oralis или в концентрации 1,5×10⁸ КОЕ/мл и 5 мл 0,9% NaCl. Чашку Петри инкубировали в течение 3 сут. при температуре 37 °С. Мембрану извлекали из чашки Петри, биопленку с мембраны смывали стерильным физиологическим раствором. К полученной суспензии добавляли в избытке 0,5% раствор Конго красного. Суспензию дважды отмывали 0,9% NaCl для удаления не связавшегося Конго красного с осаждением матрикса центрифугированием при 1000 оборотов в мин. (200 g) в течение 75 мин. после каждой отмывки. Суспензию замораживали и хранили при –25 °С до использования.

Для приготовления рабочей суспензии матрикса биопленки разводили размороженную суспензию матрикса раствором 0,9% NaCl до оптической плотности 2,5 Е_оп на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм и 0,15 мл суспензии матрикса в лунке 96-луночного планшета для ИФА. Далее 0,1 М раствором фосфатного буфера с pH 7,4 доводили оптическую плотность суспензии до 2 Еоп. В 1 мл рабочей суспензии содержалось 12,2 мг сухого матрикса и 0,1 мг Конго красного. В качестве консерванта в суспензию добавляли азид натрия в концентрации 2 мг/мл.

Реакцию ставили в пробирках типа эппендорф. Реакционная смесь состояла из 0,1 мл исследуемого агента и 0,3 мл рабочей суспензии экзополимерного матрикса биопленки. Препараты ферментов – лизоцим (Sigma), протеиназа К (Sigma), гиалуронидаза бычья и стрептококковая, трипсин, пепсин, альфа-амилаза, ДНК-аза, рибонуклеаза, пероксидаза – все в концентрации 1 мг/мл. Препараты антисептиков использовались в рабочей концентрации. После инкубации в течение 24 ч при 37 °С реакционную смесь центрифугировали 10 мин. при 10 тыс. оборотов в мин. (7930 g) на центрифуге MIKRO 120 (Hettich) для осаждения не разрушенных компонентов матрикса и переносили по 0,15 мл надосадка в лунки планшета для иммуноферментного анализа. Далее производили учет результатов реакции по увеличению оптической плотности надосадка на многоканальном спектрофотометре Ф300 ТП при длине волны 492 нм в сравнении с отрицательными контрольными пробами, где вместо раствора исследуемого препарата использовали 0,9% NaCl.

Результат выражался в пикокаталах, которые рассчитывались как разница оптических плотностей опытных проб и соответствующих им контрольных.

X(пкат)=(0,0027+1,7* Еоп)²

Где X – искомый результат;

Еоп – оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля

Результаты определения способности ферментов разрушать экзополимерный матрикс биопленки S. oralis представлены в таблице 1.

Таблица 1.Способность ферментов к расщеплению экзополимерного матрикса биопленки S. Oralis

№ п/п	Фермент	Активность, (среднее арифметическое±стандартное отклонение)
1	Амилаза	0,001±0,0005
2	Лизоцим	0,0012±0,0009
3	Пепсин	0,0073±0,001
4	Пероксидаза	0,008±0,001
5	Протеиназа	0,092±0,009
6	Гиалуронидаза I (бычья)	0,2±0,004
7	ДНКаза	0,009±0,0009
8	Трипсин	0,00003±0,00001
9	Гиалуронидаза III (стрептококковая)	0,008±0,0004
10	Папаин	0
11	Рибонуклеаза	0,0017±0,0002

Из ферментов наибольшая активность наблюдалась у гиалуронидазы I типа (бычья). В тоже время папаин подобной активностью не обладал. Наиболее активным антисептиком на основании опытных данных является димексид 2% 1,33±0,03 пкат, активность перекиси водорода 3% составила 0,0024±0,0002 пкат. Однако у септомирина, хлоргекседина биглюконата, фурациллина и йодиксина активности не было.

Выводы:

1. Разработан метод для оценки способности ферментов и антисептиков разрушать экзополимерный матрикс биопленки, образованной S.oralis

2. Наибольшая активность из исследованных ферментов наблюдалась у гиалуронидазы I типа, что, вероятно, связано с расщеплением полисахаридов матрикса

3. Наибольшую активность из антисептиков по отношению к матриксу биопленки S.oralis показал препарат димексид 2%