2.Материалы и методы

2.1Материалы

2.1.1 Используемые приборы

1. Многоканальный программируемый термоциклер (амплификатор) ТЕРЦИК (ЗАО “НПФ ДНК-Технология”, Россия).

2. Универсальная микроцентрифуга Centrifuge 5414 (“Eppendorf”, Германия).

3. Вортекс MINIGEN TYPE 4TEC.

4. Генетический анализатор ABI PRISM 3100 (“Applied Biosystems”, США)

5. CFX Real-Time PCR Systems («Bio-Rad», США).

2.1.2 Готовые наборы реагентов

1. 10х реакционный буферный раствор для амплификации

2. Набор для секвенирования ABI PRISM^® BigDye™ Terminator v. 3.1

3. Буфер Ap-1 (буфер для лизиса)

4. Буфер WIA (буфер очистки)

5. Буфер W2 (десолирующий буфер)

6. Буфер ТЕ ( 5mM, Tris-HCl, 0,1 mM ЭДТА, pH 8,5)

2.1.3 Ферменты

1. Taq-полимераза (“Бионем”, Россия)

2. Ap-2 (протеинкиназа)

2.1.4 Растворы

1. Экстракционный буфер: 10мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,5% SDS, 4мМ NaCl, pH 8,0, деионизированной воды до 1 л.

2. 30%-ный раствор акриламида; 145 г акриламида, 5 г N,N-метиленбисакриламида, до 0,5 л дистиллированной воды.

3. Буфер TBE: 108 г Tris-основного, 55 г борной кислоты, 40 мл 0,5 М ЭДТА, перед использованием развести в 10 раз.

4. Буфер для внесения в гель : 300 мкл глицерина, по 0,25 г бромфенолового синего и ксиленцианола, до 1 мл дистиллированной воды.

2.2Методы

2.2.1 Выделение днк из лейкоцитов периферической крови методом высаливания

1. К 700 мкл венозной крови добавляли 700 мкл бидистиллированной воды и центрифугировали в течение 15 мин при 12 тыс. об. мин;

2. Супернатант удаляли, оставшийся осадок растворяли в 1000 мкл бидистиллированной воды и центрифугировали 15 мин при 12 тыс. об. мин;

3. Снова удаляли супернатант, оставшийся осадок растворяли в 270 мкл 0,2М растворе ацетата натрия. Добавляли 40 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия и перемешивали переворачиванием;

4. Добавляли 150 мкл хлороформа и 300 мкл насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивали смесь переворачиванием. Пробу центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 12 тыс. об. мин., затем отбирали супернатант в отдельную пробирку;

5. К супернатанту добавляли 2,5 объема этанола 96% и выдерживали образец 30 мин при температуре -20° С, перемешивали переворачиванием;

6. Образовавшийся осадок вынимали с помощью стеклянной палочки, высушивали при температуре 60° С и растворяли в бидистиллированной воде;

2.2.2 Выделение днк из лейкоцитов периферической крови при помощи AxyPrep Blood Genomic dna Miniprep Kit.

1. Добавить 500 мкл буфера Ap-1 в 1,5 мкл эпиндорф;

2. Добавить 200-250 мкл антикоагулированной цельной крови (аналогично моча) и перемешать на вортексе 10 секун;

3. Добавить 100 мкл буфера Ар-2 и перемешать на вортексе 10 секнуд;

4. Центрифугировать 10 минут при 12000хg;

5. Добавить супернатант из предыдущего пункта в колонку, вложенную в 2 мкл бюкс и центрифугировать 1 минуту при 12000хg;

6. Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс и добавить туда 700 мкл буфера WIA. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре и центрифугировать 1 минуту при 12000xg;

7. Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс и добавить туда 800 мкл буфера W2. Центрифугировать 1 минуту при 12000xg;

8. Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс и добавить туда 500 мкл буфера W2. Центрифугировать 1 минуту при 12000xg (для лучшей очистки);

9. Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс. Центрифугировать 1 минуту при 12000xg;

10. Поместить колонку в 1,5 мкл пробирку и добавить 80-200 мкл ТЕ буфера (он должен быть предварительно разогрет до 65°С). Инкубировать 1 минуту, центрифугировать 1 минуту при 12000хg.