2.2.4 Электрофорез пцр-продуктов в 1,5% агарозном геле.

Гель-электрофорез – метод разделения смеси молекул ДНК по размеру. Он основан на том, что молекулы ДНК в буферном растворе заряжены отрицательно и под действием электрического поля движутся к аноду. Если электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле, то поры геля обладают эффектом сита, и в результате малые молекулы движутся к аноду быстрее, чем большие. Разделяющая способность геля зависит от размера пор, который в свою очередь, зависит от концентрации геля. Например, в 5%-й агарозный гель позволяет фракционировать молекулы ДНК размером 100-500 п.н., в то время как в 0,5%-м можно разделить молекулы размером 5-20 тыс. п.н. Полиакриламдные гели (ПААГ) используются для фракционирования фрагментов ДНК меньшего размера, вплоть до фрагментов, различающихся между собой на несколько нуклеотидов. Положение отдельных молекул ДНК при электрофорезе оценивают с помощью красителей бромфенолового синего и ксиленцианола.

В настоящей работе разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе проводили с помощью горизонтального агарозного 1,5% геля. Он готовиться на основе ТАЕ или ТБЕ буфера. К 1,5 гр агарозы добавляется 100 мл буфера и доводится до полного растворения в микроволновой печи. После чего, в полученный жидкий гель добавляется 8-10 мкл бромистого этидия на 100 мл продукта для последующего проявления в ультрафиолете. Гель быстро заливается в приготовленную плашку и инкубируется в течение получаса до полного охлаждения. Электрофорез проводили при постоянной силе тока в 400 мА с использованием камеры для горизонтального фореза (“Хеликон”, Москва) в течение 20-30 минут. Визуальный контроль миграции ПЦР-продуктов осуществли относительно положения красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. После чего гель помещали на трансиллюминатор, где оценивали результат.

2.2.5 Очистка пцр продукта.

Это группа методов для очистки ПЦР продукта от остатков dNTP, несвязавшихся праймеров и «лишних» амплифицрованных участков ДНК. Очистка используется для подготовки ПЦР продукта к секвенированию и ряда других исследований, налагающих жесткие условия на «чистоту» образца. Существует множество методов очистки ПЦР продукта. Каждый из них имеет свои положительные и отрицательные стороны, которые

2.2.5.1 Метод элюции ДНК из агрозного геля с помощью центрефугирования.

Этот метод является одним из основных для подготовки ПЦР продукта к секвенированию. Его безусловный плюс состоит в универсальности. Используя метод элюции из агарозного геля ПЦР продукта можно гарантировать результат при неотработанных новых условиях реакции и больших контаминациях ПЦР микса. Но у этого метода есть и недостатки: во-первых, он достаточно труден в осуществлении при отсутствии необходимого опыта и сноровки, а во-вторых, выход очищенного ПЦР продукта гораздо меньше, чем в остальных методах.

Принцип метода – после проведения электрофореза на агарозном геле необходимо найти «полосу» фрагмента необходимой длины. Это производится относительно заводского маркера или же окрашенной плазмиды. После нахождения фрагмент вырезается и помещается минимум на час в морозильник на -4 для охлаждения. Далее вырезанный кусочек геля помещается в колонку и откручивается на центрифуге 5 минут при 12000хg. К получившемуся осадку добавляют двойной объем 96% этилового спирта, после чего центрифугируют 15 минут при 12000xg. В результате, в пробирке будет осадок содержащий ДНК. Необходимо изъять спирт из пробирки при помощи микропипетки или водяного насоса и поставить ее инкубировать в термостат при 37°С. После того как весь спирт испариться к осадку добавляют 10 мкл бидистилированой воды.

2.2.5.2 Использование Illusta MicroSpin Kit.

Этот метод хотя и проще описанного выше, но требует определенной подготовки ПЦР продукта. Набор реактивов удаляет остатки dNTP и несвязавшиеся праймеры. Таким образом, ПЦР продукт должен быть «чистым» от неспецифически амплифицированных участков. Принцип метода – ресуспензировать колонку с гелем (заводской комплект) на вортексе. Оторвав «хвост» и приоткрыв крышку колонки, поместить ее в 1,5 мл пробирку. Центрифугировать 1 минуту при 735xg. Добавить на поверхностность застывшего геля 25-100мкл ПЦР продукта, поместить колонку с гелем в новую пробирку. Центрифугировать 2 минуты при 735xg. Полученный фильтрат в пробирке является очищенным ПЦР продуктом.

2.2.5.2 Использование ферментов SAP и Exo1

Эти ферменты удаляют dNTP и одноцепочечные последовательности (праймеры). Принцип метода похож на описанный выше, только занимает несколько больше времени. Вначале к каждым 15 мкл продукта добавляют 5 ЕА SAP и 2 EA Exo1. После быстрого перемешивания на вортексе необходимо инкубировать смесь при температуре 37°С в течение часа. Далее, для инактивации ферментов следует инкубировать смесь в течение 15 минут при температуре 75°С. Полученная смесь и является очищенным ПЦР продуктом, который можно хранить до 5 месяцев при температуре 4°С.