2.2.7. Пцр в реальном времени.

Этот метод является одним из видов ПЦР. С его помощью можно наблюдать результат амплифицирования во время реакции, а не только по окончанию всех циклов. Это стало возможным благодаря встраиванию флуоресцентной метки в амплифицируемую ДНК. Флуоресцентный краситель может быть встроен в праймер вместе с «гасителем». Когда проходит амплификация «гаситель» отрывается полимеразой и праймер начинает флуоресцировать, так называемые красители для меченых олигонуклеотидов. В этой работе был использован иной метод окрашивания. Флуоресцентный краситель Sybr Green I присоединяется к двухцепочечному фрагменту ДНК и начинает поглощать свет в средневолновой области (λ_max = 497 нм) и испускать свет с максимальной длиной волны 520 нм (рисунок 4). Это так называемый дуплекс-специфичный интеркалирующий краси­тель.

Рисунок 4. Зависимость доли максимальной флуорисценции поглощения или испускания Sybr Green I от длины волны.

Сущность реакции ПЦР в реальном времени состоит в следующем – есть область гена, которую фланкируют праймеры (реверс и форвард), эта область множество раз копируется и накапливается ДНК соответствующей длины. Причем за каждый цикл количество продукта увеличивается в 2 раза. Реактивы, использующиеся для ПЦР в реальном времени по сути такие же как и в обычной ПЦР, но в данном эксперименте была использована готовая смесь вместе с красителем (туда входят полимераза, буфер, Mg²⁺, dNTP, краситель). Пример прописи для ПЦР в реальном времени представлен в таблице 4. Программа для амплификации ПЦР в реальном времени несколько отличается от стандартной, не считая того, что в ней присутствует стадия, в которой происходит считывание флуорисценции (обычно это стадия элонгации), стадии элонгации и отжига праймеров совмещены (пример - таблица 5).

Реактив	1х, мкл	8х, мкл
SYBR mix	12.5	100.0
Pr. F	0.3	2.4
Pr. R	0.3	2.4
ДНК	1	8
H2O	10.9	87.2
Общий объем	25	200

Таблица 4. Пример прописи для ПЦР реакции в реальном времени для 1 и для 8 пробирок общего объема смеси 25 мкл.

Название стадии	Температура, °C	Время, с	Число циклов
Предварительная денатурация	95	180	1
Денатурация	95	10	39
Отжиг и элонгация*	58	30

Таблица 5. Пример программы амплификации для ПЦР в реальном времени. Звездочкой обозначена стадия, в которой происходит считывание значения флуорисценции.

Прибор, используемый для проведения ПЦР в реальном времени является модифицированным амплификатором (общая схема - рисунок 7). Считываемое значение флуорисценции заносится на прямую в компьютер, где программа обсчитывает результат и строит график (условный график – рисунок 8)

Рисунок 5. Схема организации детектирующего амплификатора

1 — пробирки; 2 — термоэлектрические (ТЭ) модули (элементы Пельтье); 3 — радиатор; 4 — зеркало; 5 — источник света возбуждения флуоресценции; 6 — светофильтр источника возбуждения; 7 — детектор излучения флуорес­ценции; 8 — светофильтр детектора; 9 — излученный световой поток; 10 — свето­вой поток возбуждения; 11 — суммарный световой поток; 12 — спектроделитель

Флуоресценцию, получаемую при использовании метода риалтайм ПЦР, можно представить следующим графиком (рисунок 6). На условной кривой флуоресценции можно различить несколько областей. Во-первых, это область первоначального накопления продукта, когда флуоресцирует изначальная ДНК и ее количество меняется не значительно, а шумы и погрешности аппарата примерно сопоставимы с самим сигналом. Этот период при обсчете данных обычно отсекают и учитывают значение. Далее идет период экспоненциального роста флуоресценции. В этот период определяют линию threshold, которая проходит на уровне начала видимого подъема флуоресценции. Эту линию легче всего найти по логарифмическому графику (рисунок 7), хотя при правильной настройке программное обеспечение устройства для риалтайм ПЦР может само ее нарисовать. Значение цикла в точке пересечения линии threshold и графиком флуоресценции называется точкой C(t). Это значение может быть как целым, так и дробным. Потом идет участок графика, когда значение флуоресценции приближается к своему максимальному значению – это так называемая область плато. Максимальное значение флуоресценции для исследования не играет большой роли, так как оно образуется в результате истощения реактивов и зависит от множества факторов: изначальной концентрации ДНК, количества праймеров, активности и количества полимеразы и тд.

Флуоресценция, у.е.

Рисунок 6. Примерный график зависимости флуоресценции меченой ДНК от цикла ПЦР реакции. Зеленой зоной отмечен период накопления флуоресценции, когда идет незначительное увеличение продукта и уровень «шума» сопоставим с уровнем сигнала. Красным обозначен период экспоненциального роста - интенсивного увеличения копий ДНК. Через точку «проявления » ДНК проведена threshold line, по которой определяется С(t). Желтым отмечена фазу плато, когда в связи с определенными обстоятельствами (нехватка dNTP, праймеров, полимеразы, разрушение матричной ДНК после многочисленных нагреваний и пр.) флуорисценция увеличивается не так стремительно и ее значение стремиться к константе

Рисунок 7. Примерный график зависимости логарифма флуоресценции меченой ДНК от цикла ПЦР реакции. Зеленой зоной отмечен период накопления флуоресценции. Красным обозначен период экспоненциального роста. Через точку «проявления » ДНК проведена threshold line. Желтым отмечена фаза плато.

Обсчет данных, полученных методом ПЦР, был произведен при помощи программного обеспечения компании Bio Rad (CFX Manager 1000 v1.6), входившего в комплект поставки амплификатора для риалтайма и при помощи пакета программ Microsoft Excel. Для нахождения threshold line и определения значений C(t) была использована программа CFX Manager 1000. А для обработки этих значений и выявления статистической достоверности данных был применен Microsoft Excel.