3. Опис виконання практики згідно з календарним планом

Практику проходили на протязі чотирьох тижнів, за цей час нами було виконано такий обсяг роботи:

• 3.08 – 4.08 – Готували небхідні для роботи розчини.

• 5.08 – 10.08 – Проводили скринінг сорбентів.

• 11.08 – 16.08 – Аналізували вихідну активність алкогольоксидази, а також її активність у “проскоках”, промивах та елюатах.

• 17.08 – готував посуд для подальшої роботи.

• 18.08 – 19.08 – Проводили електрофорез у ПААГ.

• 20.08 – 23.08 – Проводив хроматографічну очистку алкогольоксидази на обраному нами сорбенті.

• 24.08 – 25.08 – Проводили електрофорез хроматографічних фракцій.

• 26.08 – 30.08 - Заповнювали щоденники практики, оформлювали звіти про проходження навчально-виробничої практики.

• 31. 08 – Готували посуд для подальшої роботи.

Посмотри по календарю, когда были выходные.

4. Вступ

Забезпечення матеріальних та соціальних потреб людини, охорони і відтворення природних багатств та довкілля неможливе без використання мікроорганізмів – живих "хімічних фабрик", які здатні перетворювати прості речовини в найрізноманітніші корисні продукти. Ця здатність мікроорганізмів, як і всіх живих клітин, зумовлена існуванням ферментів, які здійснюють тисячі різноманітних хімічних перетворень як в клітинах, так і поза ними. Ферменти стали незамінним інструментом сучасної аналітичної біотехнології, яка поєднала досягнення аналітичної біохімії, ензимології, імунології, генної інженерії та електроніки в єдиному руслі – створенні новітніх методів аналізу та біодіагностикумів для швидкого і недорогого аналізу найрізноманітніших речовин у продуктах, довкіллі та контролю багатьох технологічних процесів.

Важливим джерелом ферментів (як природних, так і рекомбінантних) є деякі види дріджів, цвільових грибів та бактерій. Серед них особливе місце займають метилотрофні дріжджі, які завдяки наявності унікально сильного промотора алкогольоксидазного гена стали вигідним організмом-господарем для гетерологічної експресії промислово важливих білків та ферментів, у тому числі й аналітичного призначення [1;2].

Алкогольоксидаза (AO) – пероксисомний фермент метилотрофних дріжджів, який каталізує першу реакцію обміну метанолу – окислення киснем повітря до формальдегіду і пероксиду водню. Незамінність цього фермента для метилотрофного росту вперше була показана на мутанті Candida boidinii з дефектом АО [3]. Цей фермент є флавопротеїном, що містить ФАД як простетичну групу, зв’язану з апоферментом нековалентними зв’язками. Нативний білок є октамером, що складається з 8 ідентичних ФАД-вмісних субодиниць із загальною молекулярною масою близько 600 кДа. АО із різних видів дріжджів мають подібну первинну структуру і близькі спектри кругового дихроїзму, що свідчить про подібність вторинної структури білків. Кінетичні властивості ферментів різного походження теж подібні, хоча деяка відмінність у кінетичних параметрах відзначається, зокрема, в К_М відносно субстратів [4].

АО не є високоспецифічним ферментом і, крім метанолу, здатна окислювати інші первинні спирти - від етанолу до гексанолу, практично не діючи на їх вторинні та третинні ізомери. Каталітична активність фермента падає з ростом довжини вуглецевого ланцюга субстрату. Так, наприклад, якщо ефективність окислення метанолу для АО із H. polymorpha прийняти за 100 %, то етанол окислюється з відносною швидкістю 35-50 % (дані різних авторів), пропанол-1 - 25-60 %, бутанол-1 - 13-53 %. Формальдегід, який у гідратованій формі є метиленгліколем, теж окислюється АО з ефективністю 13 %.

Як відомо, AO здатна окислювати, крім первинних спиртів, і формальдегід. Це зв‘язано, вірогідно, із структурною подібністю гідратованої форми формальдегіду, метиленгліколю, до метанолу. В стані рівноваги у водних розчинах формальдегіду ця форма складає до 95-99 % від загального пулу молекул:

H

спонтанно

₂C=O + H₂O HO-CH₂-OH

Константа Міхаеліса для алкогольоксидази із H. polymorpha відносно формальдегіду близька 2,6 мМ (для метанолу - від 0,2 до 2,0 мМ, залежно від препарату фермента; для О₂ - 0,4 мМ [5]). Отже, не можна виключити участі алкогольоксидази в детоксикації формальдегіду в умовах формальдегідного стресу.

Концентрація розчиненого кисню як другого субстрату АО суттєво впливає на каталітичну активність фермента. К_М для кисню складає 0,8 мМ [6], що значно вище від величини 0,23 мМ - насичуючої концентрації кисню при 30^оС у водних розчинах при тиску повітря 1 атм. Мало того, концентрація кисню впливає на кінетичні параметри АО відносно спиртів. Для прикладу, К_М для метанолу, визначена в насичених киснем розчинах, утричі вища порівняно із величиною, отриманою за умов насичення повітрям [6].

Крім молекулярного кисню, інші електронні акцептори не підтримують алкогольоксидазну реакцію, зокрема, NAD⁺, фериціанід калію, 2,6-дихлорфеноліндофенол, метилфіолетовий, цитохром с, метиленовий блакитний.

Продукт алкогольоксидазної реакції - пероксид водню - негативно впливає на ензиматичні властивості АО, викликаючи інактивацію фермента [7]. Пероксид водню, можливо, окислює певної функціональної групи активного центру фермента, оскільки глутатіон реактивує фермент. Присутність каталази гальмує інактивацію, але не повністю [8]. Другий продукт окислення метанолу - формальдегід, хоч і є субстратом АО, водночас виступає її інгібітором, особливо за високих концентрацій. Вірогідно, це пов’язано із здатністю СН₂О реагувати з функціональними групами білка, зокрема, залишками лізину. Функціональна роль ковалентних оборотних аддуктів АО з формальдегідом in vivo невідома, хоча висловлено припущення про своєрідну буферну роль АО в пероксисомах у підтриманні нижчого рівня вільного формальдегіду в цих органелах [9].

Метою роботи було підібрати сорбент для найефективнішого очищення алкогольоксидази дріжджів Hansenula polymorpha.