5.5. Електрофорез ао h. Рolymorpha за нативних умов
Розділення білків препаратів АО, отриманих на різних стадіях очистки ферменту, проводили у 8 %-ному поліакриламідному гелі на приладі АВГЕ-1 “Himifil” (Естонія) для вертикального електрофорезу на пластинах. Проби наносили з розрахунку 60 мкг білка на лунку. Електрофорез проводили протягом 3 год у режимі 200 В/34 мА.
Фарбування електрофореграм за кольоровою реакцією проводили в суміші такого складу:
0,75 мМ бензидин 16,0 мл;
0,5 М фосфатний буфер, рН 7,0 2,0 мл;
Пероксидаза, мг/мл 1,0 мл;
0,20 М метанол 1,0 мл.
Гель інкубували 1,5 – 2 год у темноті при 30 оС.
Зафарбовані гелі сканували.
5.6. Статистична обробка результатів
Обчислення основних статистичних показників проводили за безпосередніми кількісними даними, отриманими в результаті досліджень (середнє арифметичне значення − М; стандартна похибка середнього арифметичного − m).
Для оцінки вірогідності різниці між статистичними характеристиками двох альтернативних сукупностей даних обчислювали коефіцієнт Стьюдента. Вірогідною вважали різницю при показах вірогідності р≥ 0,95 (значимості Р<0,05), знайдену після обчислення t за таблицею Стьюдента.
Обробку даних виконували на комп’ютері з використанням прикладної програми “Microsoft Excel 2003”.
6. Результати досліджень та їх обговорення
6.1. Дослідження неорганічних сорбентів з метою імобілізації алкогольоксидази
Для вибору оптимального сорбенту, здатного ефективно сорбувати АО, на колонки з сорбентами діасорб А, гепарин–G силохром, гепарин–Е силохром, діасорб-ПЕІ, граміцидин С-силохром та бацитрацин-силохром (об’ємом по 2 мл), промитих 50 мМ ФБ, рН 7.0, наносили по 1.863 Од. безклітинного екстракту штаму Тf 11-6 H. рolymorpha. Після чого колонки промивали 50 мМ ФБ, pH 7.0, в „проскоках”, промивних розчинах та елюатах визначали активність АО. Результати досліджень наведено у табл.1. Як видно з табл.1, фермент сорбувався тільки на частинках сорбенту діасорб-ПЕІ , оскільки в проскоках та промивах інших сорбентів активність АО була значною і складала 80.5 % для діасорбу А , 79 % - для гепарин – G силохрому, 77% для гепарин–Е силохрому, 73% для граміцидин С-силохрому та 68 % для бацитрацин-силохрому, а для діасорбу ПЕІ - лише 1.6 %.
Таблиця 1
Активність алкогольоксидази з дріжджового штаму Tf 11-6 H. рolymorpha в процесі імобілізації на сорбентах
Етап |
Параметри |
Дiасорб А |
Гепарин -G сил. |
Гепарин- Е сил. |
Дiасорб- ПЕI |
Грамiцидин С –сил. |
Бацитрацин- сил. |
Проскок |
V, мл |
6 |
- |
- |
- |
- |
- |
A, од/мл |
0.25 |
0.245 |
0.238 |
0.005 |
0.227 |
0.212 |
|
Σ А, од |
1.5 |
1.47 |
1.43 |
0.03 |
1.36 |
1.27 |
|
Промив |
V, мл |
6 |
- |
- |
- |
- |
- |
A, од/мл |
0.048 |
0.06 |
0.04 |
0.007 |
0.051 |
0.09 |
|
Σ А, од |
0.288 |
0.36 |
0.24 |
0.042 |
0.306 |
0.54 |
|
Елюат |
V, мл |
6 |
- |
- |
- |
- |
- |
A, од/мл |
0.012 |
0.006 |
0.005 |
0.17 |
0.012 |
0.003 |
|
Σ А, од |
0.072 |
0.036 |
0.03 |
1.02 |
0.072 |
0.018 |
Також у “проскоках”, промивних розчинах та елюатах визначали концентрацiю бiлка
за методом Лоурi. Результати досліджень наведедено у табл. 2. Як видно з табл. 2, найбільшу питому активнiсть має елюат з колонки з діасорбом ПЕІ.
Таблиця 2
Характеристика процесу імобілізації алкогольоксидази на досліджуваних сорбентах
Сорбент |
Етап |
С, мг/мл
|
Питома активнiсть Алкогольоксидази, Од/мг |
|
Дiасорб А |
Проскок |
1.162 |
0.325 |
|
Промив |
0.720 |
0.067 |
||
Елюат |
0.167 |
0.071 |
||
Гепарин – G сил. |
Проскок |
1.256 |
0.424 |
|
Промив |
0.641 |
0.093 |
||
Елюат |
0.137 |
0.044 |
||
Гепарин – Е сил. |
Проскок |
1.239 |
0.282 |
|
Промив |
0.617 |
0.065 |
||
Елюат |
0.17 |
0.029 |
||
Дiасорб ПЕI |
Проскок |
1.034 |
0.005 |
|
Промив |
0.644 |
0.01 |
||
Елюат |
0.144 |
1.18 |
||
Грамiцидин С – силохром |
Проскок |
1.501 |
0.332 |
|
Промив |
0.798 |
0.064 |
||
Елюат |
0.462 |
0.026 |
||
Бацитрацин- сил. |
Проскок |
1.386 |
0.415 |
|
Промив |
0.727 |
0.124 |
||
Елюат |
0.133 |
0.023 |
||
Крім того, деякі “проскоки”, промиви та елюати були охарактеризовані на дентатуруючому електрофорезі в ПААГ( рис.1).
1 2 3
4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Рис.1. Електрофореграми препаратів алкогольоксидази (АО) штаму Тf 11-6 метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha імобілізованої на сорбентах після денатуруючого електрофорезу в 15 % ПААГ : 1 – маркер – очищений препарат АОХ ; 2 – вихідний препарат безклітинного екстракту (БЕ); 3 – проскок з колонки Діасорб А; 4 – промив з колонки з Діасорб А; 5 – елюат з колонки з діасорб А; 6 – проскок з колонки Гепарин – G силохром; 7 - промив з колонки гепарин – G силохром; 8 – проскок з колонки Гепарин –Е силохром; 9 – промив з колонки гепарин –Е силохром; 10 – промив з колонки Бацитрацин-силохром; 11 – проскок з колонки Бацитрацин-силохром; 12 - промив з колонки Граміцидин С – силохром; 13 – проскок з колонки Граміцидин С – силохром; 14 – елюат з колонки Діасорб ПЕІ; 15 – промив з колонки Діасорб ПЕІ; 16 – проскок з колонки Діасорб ПЕІ; 17 – вихідний препарат БЕ; 18 – маркер АОХ.
Як видно з рис. 1, елюат з колонки Діасорб-ПЕІ є найбільш гомогенним, тому для подальших досліджень було обрано саме цей сорбент.