6.2. Хроматографічна очистка алкогольоксидази на сорбенті діасорб пеі
На колонки з сорбентом Діасорб ПЕІ (об’ємом 2 мл), промиту 50 мМ ФБ, рН 7,0, наносили 8.061 Од. БЕ (з питомою активністю 0.160 Од./мг білка), зі штаму Тf 11-6 H. рolymorpha. Після чого колонку промивали 50 мМ ФБ, pH 7.0, в „проскоках”, промивних розчинах та елюатах визначали активність АО. Елюцію проводили 0.1 М NaCl, 0.5 M NaCl тa 1 M NaCl відповідно. Результати досліджень наведено у табл.3. Як видно з табл. 3, активність АОХ зростає при кожній наступній стадії елюції.
Таблиця 3
Активність алкогольоксидази з дріжджового штаму Тf 11-6 H. рolymorpha при очистці на сорбенті Діасорб-ПЕІ
|
V, мл |
A, од/мл |
Σ А, од |
Проскок |
6 |
0.370 |
2.22 |
Промив |
- |
0.009 |
0.054 |
Елюат 0.1 М NaCl |
- |
0 |
0 |
Елюат 0.2 М NaСl |
- |
0.028 |
0.168 |
Елюат 1 М NaСl |
- |
0.146 |
0.876 |
Елюат 2 М NaCl |
- |
0.165 |
1 |
Також у “проскоках”, промивних розчинах та елюатах з сорбенту Діасорб-ПЕІ визначали концентрацiю бiлка за методом Лоурi . Результати досліджень наведено у табл. 4. Як видно з табл. 4, найбільшу питому активнiсть має елюат 2 (1 М NaCl), де очистка препарату алкогольоксидази відбулась у 13 разів у порівнянні із вихідним БЕ.
Таблиця 4
Характеристика очистки АОХ в процесі хроматографії на сорбенті Діасорбі-ПЕІ
Етап хроматографії |
С, мг/мл |
Питома активнiсть, Од/мг |
Проскок |
0.460 |
0.08 |
Промив |
0.049 |
0.02 |
Елюат 0.1 М NaCl |
0.019 |
0 |
Елюат 0.2 М NaCl |
0.020 |
0.14 |
Елюати 1 М NaCl 1 2 |
0.017 0.008 |
0.86 2.06 |
Проскоки, промиви та елюати з сорбенту Діасорб-ПЕІ було охарактеризовано електрофоретично в нативному та денатуруючому ПААГ ( рис. 2 та 3).
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. Електрофореграми білкових препаратів в ході очистки АО штаму метилотрофних дріжджів H. polymorpha на сорбенті Діасорб-ПЕІ. Денатуруючий електрофорез в 15 % ПААГ: 1 – проскок; 2 – промив; 3 – вихідний препарат БЕ; 4 - елюат 0.1 М NaCl ; 5 – елюат 0.5 М NaCl; 6 – елюат 1 (1 М NaCl); 7 – елюат 2 (1 М NaCl).
1 2 3 4 5 6 7
Рис.3. Електрофореграми препаратів алкогольоксидази (АО) в ході очистки БЕ метилотрофних дріжджів H. polymorpha на сорбенті Діасорб ПЕІ. Після нативного електрофорезу в 8% ПААГ: 1 –БЕ; 2 – проскок; 3 – промив; 4- елюат 0.1 М NaCl ; 5 – елюат 0.5 М NaCl; 6 – елюат 1 (1 М NaCl); 7 – елюат 2 (1 М NaCl).
На електрофореграмах також видно, що елюат 2, 1 М NaCl, є найбільш гомогенним.