3.1. Відбір зразків патологічного матеріалу, крові та пересилання їх для лабораторного дослідження

Для проведення діагностичних досліджень на ящур й інші везикулярні хвороби відбирають вмістиме афт (лімфу) на слизовій оболонці язика (велика рогата худоба), на п'ятачку (свині), на шкірі вінчика й міжратицевої щілини (велика і дрібна рогата худоба, свині, верблюди та інші сприйнятливі до ящуру види тварин). За відсутності афт для виділення вірусу відбирають проби крові в період підвищення температури тіла в тварин, а також лімфатичні вузли голови та заглоткового кільця, підшлункову залозу і м'язи серця (трупи молодняку всіх видів тварин).

Для ретроспективних діагностичних досліджень на ящур і інші везикулярні хвороби відбирають стравохідно-глотковий слиз у будь-який час після передбачуваного інфікування тварин вірусом, а також парні проби сироватки крові, одна з яких повинна бути отримана відразу ж після появи клінічних ознак захворювання тварини, а друга - через 14 днів після одужання.

Афти і лімфу відбирають у кількості не менше 5 грамів. Кількість інших матеріалів, що призначені для виділення вірусу і його подальшої ідентифікації, повинна бути не менше 10 грамів. За неможливості отримання вказаних кількостей, матеріали направляють у максимально можливих кількостях для подальшого розмноження в культурах клітин і інших лабораторних системах.

Проби патологічного матеріалу без ознак розкладу повинні бути вміщені у флакони з притертими пробками або такими, що загвинчуються, і замороженими, а за відсутності умов для заморожування - залиті консервувальною рідиною. Для стінок афт консервувальна рідина складається з однакових об'ємів нейтрального гліцерину та 0,85 %-го розчину хлористого натрію або середовища для культивування клітин (без сироватки). Інші матеріали консервують розчинами антибіотиків із розрахунку 500 – 1000 ОД на см³ або 1 грам матеріалу.

Флакони з пробами герметизують, забезпечують етикетками де вказують: вид тварин, найменування і кількість матеріалу, консерванту, час отримання і поштову адресу відправника. Флакони вміщують у контейнери з льодом або холодоносієм і доставляють в опечатаному вигляді на дослідження нарочним у можливо короткий термін, але не пізніше 48 год. з моменту відбору. У разі, коли матеріали можуть бути доставлені за 6-12 год. з моменту відбору, їх заморожування і консервація необов'язкові.

У супровідному документі на матеріали, що надсилаються для проведення лабораторної діагностики ящуру й інших везикулярних хвороб, повинні бути наведені дані епізоотологічного обстеження неблагополучного господарства (району, області) із зазначенням загального поголів'я тварин, які сприйнятливі до цих хвороб, дату появи перших ознак захворювання, дату останньої вакцинації, серії використаної вакцини, кількості тварин, які захворіли та загинули, дати відбору проб, клінічних ознак хвороби.

Із первинних вогнищ ящуру, а також при появі його серед вакцинованих тварин, наявності атипових форм перебігу, при виникненні вогнищ у прикордонних районах і в безпосередній близькості до міжнародних транспортних вузлів (морські порти, залізничні станції, аеропорти), підприємствах біологічної промисловості й закладах, що працюють з вірусом ящуру, негайно відправляють зібрані матеріали в герметичних і опечатаних контейнерах (термосах) у Державний науково-дослідний інститут з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи (ДНДІЛДВСЕ).

3.2. Методи лабораторної діагностики ящуру варіюють залежно від того, чи необхідне раннє виявлення і типова (варіантна) ідентифікація вірусу (рання діагностика) або виявлення та ідентифікація специфічних протиящурних антитіл у тварин-реконвалесцентів (ретроспективна діагностика).

Лабораторна діагностика заснована на виділенні вірусу, індикації, ідентифікації та типуванні вірусу ящуру.

Ефективність виділення вірусу з патологічного матеріалу підвищується при застосуванні методів очищення і концентрування вірусвмісної суспензій. Завдяки зручності виконання, економічності, а головне, можливості швидкого отримання результатів, що дозволяють одночасно визначити типову та варіантну приналежність епізоотичного вірусу, найчастіше застосовують реакцію зв´язування комплементу (РЗК) або реакцію тривалого зв´язування комплементу (РТЗК). Однак, коли кількості вірусвмісного матеріалу недостатньо для дослідження або РЗК дає негативний результат або неспецифічну затримку гемолізу, то ставлять біологічну пробу на великої рогатої худоби (не менше 2 голів) у віці 18 міс, вводячи 0,1 см³ суспензії отриманого матеріалу у кілька точок слизової оболонки язика та м’якушей кінцівок; загальний обсяг дослідного матеріалу 2‑3 см³. Поява афт на місці введення матеріалу з наступним підтвердженням в РЗК свідчить про наявність збудника. Однак метод коштовний і пов'язаний з небезпекою виносу вірусу за межі установи. Тому в діагностичній практиці він застосовується дуже рідко. Частіше для біологічної проби використовують мишенят-сисунів 4-6 добового віку, мурчаків масою не менше 500 г та первинну культуру клітин нирок телят, поросят, ягнят, щитовидної залози великої рогатої худоби та перещеплюваних клітини. Біопроба на мишах зручна і економічна. LD₅₀ дослідного штаму на мишенята-сисунах і великій рогатій худобі однакові. Мишенята-сисуни більш чутливі до вірусу ящура, ніж мурчаки. Однак необхідно мати на увазі, що оцінка результатів титрування на мишенятах-сисунах нерідко скрутна.

Мурчаки легко заражаються за інтрадермального введення вірусвмісного матеріалу в плантарну поверхню задніх лапок у дозі 0,2‑0,5 мл. Заражають не менш 5 голів. Первинні ураження зазвичай з'являються через 2‑5 діб (по міру дозрівання). Вторинні ураження (везикули у ротовій порожнині), зазвичай розвиваються при зараженні штамами, адаптованими до мурчаків.

Для виділення вірусу найчастіше використовують первинно-трипсинізовану культуру клітин нирок свиней або телят, за якими спостерігають упродовж 7 діб, з щоденною мікроскопією. Специфічна дегенерація клітин при підтвердженні її специфічності в РЗК свідчить про наявність збудника ящура у дослідному матеріалі.

Серологічний метод

Суть методу полягає у виявленні специфічного антигену того чи іншого типу і варіанту вірусу ящура безпосередньо в матеріалі, отриманому від тварин з клінічними ознаками захворювання, за допомогою реакції зв'язування комплементу (РЗК).

Підготовка до дослідження

Суспензії стінок і вмістимого афт розводять з 1 : 2 до 1 : 32 0,15 М розчином хлористого натрію, вероналовим буфером або середовищем для культивування клітин та розливають у серологічні пробірки по 0,1 см³ або лунки панелей для мікросерологічних реакцій по 0,025 см³. Необхідне число пробірок (лунок), заповнюють кожним розведенням дослідної суспензії, що дорівнює числу штамів специфічних сироваток і контролів на антикомпліментарність та гемолітичні властивості.

Для приготування гемолітичної системи еритроцити барана трикратно відмивають від консерванту 0,15 М розчином хлористого натрію та центрифугують за 600 об / хв упродовж 5‑7 хв. та готують робочу суспензію змішуванням 2 см³ осаду з 98 см³ розчинника. До отриманої суспензії еритроцитів при постійному перемішуванні доливають поступово рівну кількість гемолізина, розведеного 0,15 М розчином хлористого натрію з таким розрахунком, щоб його кінцеве розведення було у 4 рази більше. Потім суспензію витримують упродовж 15‑20 хв. у водяній бані за температурі 37 ^оС або при кімнатній температурі.

При постановці РЗК на панелях для мікрореакцій концентрацію еритроцитів у гемолітичної системі збільшують у 2 рази.

Готують робочі розведення сироваток і антигенів для діагностики везикулярних хвороб сільськогосподарських тварин.

Проведення дослідження

У підготовлені і заповнені пробірки (лунки), вносять рівні об'єми штаммоспецифічних сироваток у робочому титрі та робочого розведення комплементу, що містить 5 СН₅₀. У контролях дослідного патологічного матеріалу на антікомплементарність замінюють сироватки рівним об'ємом розчинника, а в контролі на гемолітичні властивості – розчинником замінюють і комплемент. Підготовлені зависи після змішування і поміщають у водяну баню або термостат за 37 ^оС на 30 хв., після чого до них додають суспензію еритроцитів, сенсибілізованих гемолізином, в об´ємі 0,2 см³ (пробірки) або 0,05 см³ (лунки), енергетично струшують та витримують за 37 ^оС упродовж 20 хв.

Пробірки або панелі витягують з термостата або водяної бані і осаджують еритроцити центрифугуванням упродовж 5 хв. з частотою обертання 600 об / хв або відстоюванням упродовж 2‑3 годин за кімнатної температурі.

При дослідженні недоброякісного афтозного матеріалу, а також при дослідженні серцевого м'яза кількість дослідної суспензії збільшують у 4 рази при збереженні кількості і концентрації інших компонентів реакції у звичайних дозах.

Для підвищення чутливості РЗК застосовують реакцію тривалого звязування комплементу (РТЗК), за якої перша фаза проводиться за 4 ^оС упродовж 16‑20 год.

Обробка результатів

Оцінку результатів проводять візуально.

Реакцію вважають позитивною, якщо в ряду пробірок (лунок) з якою-небудь штамоспецифічною сироваткою відмічається затримка гемолізу не менше 50 % еритроцитів за повного гемолізу в паралельних рядках з іншими штамоспецифічними сироватками і в контролі з пробами патологічного матеріалу на антикомпліментарність. Збудник відноситься до того варіанту вірусів ящуру, з сироваткою якого титр дослідної суспензії виявиться вище.

Негативна реакція не виключає ящура чи іншого схожого з ним захворювання, оскільки концентрація вірусоспецифічного антигену в дослідному матеріалі може виявитися занадто низькою для виявлення в РЗК.

Методи виділення вірусу

Суть методів полягає у виявленні біологічної дії вірусу на сприйнятливі і чутливі біологічні системи та його подальшої ідентифікації серологічним методом.

Підготовка до дослідження

Суспензії стінок і вмістиме афт, які виявилися неактивними в РЗК, а також суспензії лімфатичних вузлів, серцевого м'яза, підшлункової залози, крові що згорнулась та стравохідноглотковий слиз використовують для зараження моношарових культур первинно трипсінізірованих клітин (СП, ВП, ПЯ, щитовидної залози великої рогатої худоби), перещеплюваних ліній (ВНК‑21 і IВ‑RS‑2), десять мишенят 3‑6-добового віку і п'ять мурчаків. Допускається зараження двох голів великої рогатої худоби 18-місячного віку та чотирьох поросят 3-місячного віку, що не містять в крові специфічних антитіл.

Проведення дослідження

Проведення біологічної проби на культурах клітин

Відбирають пробірки (флакони) з добре сформованим монослоем без ознак старіння і неспецифічної дегенерації. На кожну пробу дослідного матеріалу беруть по 10 пробірок або по 2‑3 флакони з перерахованими клітиними культурами. Безпосередньо перед інокуляцією культури двічі відмивають від ростового живильного середовища розчином Хенкса. Потім у пробірочну культуру вносять по 0,1‑0,2 см³, а у флакони від 0,5 до 10 см³ (залежно від площі моношару) дослідних суспензій. Інокульовані культури витримують у термостаті за температурі 37 ^оС упродовж 60 хв., потім звільняють від досліданої суспензії і заливають підтримуючим живильним середовищем. Одночасно ставлять контроль на цитотоксичність розчину Хенкса. Інокульовані контрольні культури поміщають у термостат за температури 37 ^оС упродовж 7 діб проводять мікроскопію для виявлення дегенерації клітин. У разі виявлення дегенерації тільки в інокульованих культурах проворить додатковий пасаж культуральної суспензії, отриманої після однократного заморожування культур з дегенерацією моношару за температури 20 ^оС. Отриману при цьому суспензію освітлюють центрифугуванням упродовж 15 хв. з частотою оберту 3000 об / хв. і потім заражають вихідні культури у тому ж порядку, який передбачений для дослідних суспензій проб патологічного матеріалу.

Специфічність дегенерації клітин перевіряють в РЗК.

Проведення біологічної проби на тваринах

Біологічну пробу ставлять на мурчаках, мишенятах 3‑6-добового віку і природно-сприйнятливих до ящуру тварин.

Використовують клінічно здорових особин, в анамнезі яких повністю виключені попередні контакти з вірусом ящуру. Мишенятам дослідну суспензію інокулюють підшкірно в дозі 0,1 см³, мурчакам - в шкіру подушечок обох задніх кінцівок методом тунелювання в дозі 0,2‑0,5 см³. Великій рогатій худобі матеріал вводять в товщу епітелію язика та в м´якуші кінцівок у дозі 2‑3 см³. За інокульованими тваринами спостерігають упродовж 7 діб. У разі загибелі піддослідних мишенят проводять додатковий пасаж матеріалу, виготовленого з тушок загиблих мишенят, і дослідження в РЗК.

При появі у решти видів тварин везикулярних уражень шкіри в місцях інокуляції дослідного матеріалу відбирають проби вмістимого афт, готують з них суспензії і досліджують в РЗК.

Обробка результатів

Пробу дослідного патологічного матеріалу вважають негативною, якщо в другому і наступному пасажах не буде відзначено дегенерації клітин та загибелі білих мишенят, а при дослідженні отриманих з них суспензій в РЗК не буде виявлений антиген вірусу ящуру.

Індикація та ідентифікація вірусу. В якості експрес-методу широко застосовується полімеразно-ланцюгова реакція. Це швидкий й чутливий метод виявлення збудника у тканинах шляхом ензиматичної ампліфікації РНК гена полімерази.

РЗК за 100 %-вим гемолізом застосовується для визначення типу та підтипу (варіанту) віруса ящура, що викликав захворювання тварин, а також для перевірки виробничих штамів віруса ящура при виготовленні вакцин і лабораторних штамів у науково-дослідній роботі.

Антигенна спорідненість (R) більше 70 % свідчить про те, що штами за антигенними властивостями ідентичні один одному та відносяться до одного і того ж варіанту, від 10 до 70 % - до різних варіантів і менше 10 % - до різних типів.

Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА) - простий, прискорений, чутливий метод ідентифікації віруса ящура. За чутливістю реакція перевершує загальноприйнятий метод типування віруса ящура в РЗК у 8‑16 разів. Її сутність полягає у тому, що навантажені антитілами (АТ) еритроцити аглютинуються при контакті з ящурним антигеном (АГ) гомологичного типу.

Типування віруса ящура.

Визначення типу віруса ящура методом перехресного імунітету. Випробування перехресного імунітету на великої рогатої худобі з метою визначення типової приналежності польового штаму віруса ящура проводиться лише у тому випадку, якщо по лабораторним тестам виявляється новий тип віруса ящура, який раніше не зустрічався в країні.

Визначення типу віруса ящура методом перехресного імунітету можливо і на мурчаках. Штами вважають ідентичними, якщо вакцина оберігає тварин від розвитку генералізованого процесу при зараженні використаними штамами. У разі іммунологічної відмінності штамів вакциновані тварини, інфіковані гетерологічним штамом, захворюють на генералізовану форму ящура.

При визначенні у культурі клітин типу віруса ящура його відносять до того типу, сироватка проти якого запобігає розвитку цитопатичної дії.

Розроблено варіант універсальної еритроіммуноадсорбції (УЕІА), що дозволяє визначати антигена выруса ящура у більш високих титрах, ніж в РЗК і РПГА.

Імуноферментний аналіз (ІФА) – метод подудований на використанні антитіл, кон'югованих різними ферментами, й за багатьма параметрами перевершує традиційні методи імунологічної діагностики. Особливої уваги заслуговує його висока чутливість та специфічність, експресність, об'єктивність обліку результатів. У даний час цей метод рекомендований Всесвітньою довідковою лабораторією МЕБ по ящуру.

На при кінці 20 сторіччя було розроблено діагностичні набори для виявлення антигену вірусу ящуру в ІФА, до складу яких входили усі необхідні для постановки аналізу специфічні і неспецифічні компоненти. Набори застосовували замість або поряд з реакцією зв'язування комплементу (РЗК) та біологічною пробою на первинній культурі клітин (СП). Недоліком РЗК була її низька чутливість, а недоліком біологічної проби - необхідність особливих умов при роботі з живим збудником, у той час як ІФА дослідження проводяться з інактивованим антигеном, а чутливість методу вища, ніж РЗК. До теперішнього часу за допомогою наборів досліджують матеріали, що надходять для діагностики ящуру та інших везикулярних хвороб тварин.

Високоефективний для виявлення як 146S, так і 125-компонент віруса ящура. Цей метод у 500 разів чутливіший за РЗК при дослідженні проб афтозного епітелію. Встановлена висока ступінь специфічності та чутливості ELISA для ідентифікації та типування віруса ящура всіх 7 серотипів в епітеліальних тканинах. Встановлена висока чутливість сендвіч-варіанту ІФА (на основі лужної фосфатази), який за ефективністю перевершує у 207‑219 разів, а з хромогеними субстратами - у 4‑64 рази.

ІФА може бути придатною в системі лабораторної діагностики ящуру при дослідженні діагностичних штамів. Для виявлення атитіл до віруса ящура в ІФА можна використовувати проби крові, висушені на фільтрувальному папері.

Імуноферментний аналіз (ІФА) і полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) мають перевагу перед іншими імунохімічними реакціями.