Детекция продуктов амплификации
Для того чтобы обнаружить продукты амплификации в режиме реального времени, используют следующие наиболее распространенные подходы:
Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay)
Эта методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, которые состоят из флуоресцентной метки в 5'-положении и гасителя флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатной группа в 3'-положении. Данные зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа блокирует полимеразу в 3'-положении.
В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК и чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Так происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя. Это приводит к увеличению детектируемого свечения. Чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.
Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).
Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)
Эта методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, поэтому при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют шпильки. Внутренняя область зондов содержит нуклеотидную последовательность, которая комплиментарна амплифицируемой области. При отжиге праймеров зонды, которые не присоединились к ДНК матрице, остаются в "схлопнутом" состоянии, происходит тушение флуоресценции.
Зонды, отжигающиеся на матрицу, разворачиваются, и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные стороны, поэтому увеличивается интенсивность свечения.
Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)
Указанный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов. Принцип этого метода заключается в том, что энергия переносится от одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму флуорофору, который находящемуся на 5` конце второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида.
При одновременном связывании обоих зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором, из-за этого возрастает специфичность анализа.
Использование интеркалирующих агентов
Данный способ детекции основан на сильном возрастании флуоресценции бромистого этидия и SYBR Green I при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Следовательно, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.
Можно отметить тот факт, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения правильных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves).