7.4 Научные исследования

В ходе проведения исследований, кПЦР чаще используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Этот метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определенного гена, к примеру, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды. Он может использоваться для определения зиготности трансгенных животных, которые используются в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально может быть модифицирован.

7.5 КПцр для определения количества малых ядрышковых рнк (мяРнк)

мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют достаточно малую длину (в целом 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения данных проблем используют подходы, которые основаны на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру.

7.6 Пцр в реальном времени для измерения количества белка

Для измерения количества белка в клетке используют следующий подход:

1. Создают два вида антител к целевому белку с пришитыми последовательностями ДНК так, что при взаимодействии с белком, 3’ конец одной последовательности оказывается недалеко от 5’-конца второй ДНК последовательности.

2. Получается, что каждой молекуле белка соответствует известная последовательность ДНК, количество которой потом можно анализировать с помощью классического кПЦР-анализа.

7.7 Обнаружение фитопатогенов

Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, которая не содержит патогенных микроорганизмов для того, чтобы предотвратить экономические потери и увеличить сроки хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы, которая приводит к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, характерной для каждого таксона.

7.8 Детекция генетически модифицированных организмов

кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может использоваться для детекции ГМО, так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. В этом случае, специфические праймеры используются для амплификации промотора, терминатора или даже промежуточных последовательностей, использующихся в процессе создания вектора. Так как процесс создания модифицированного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также часто оценивается с помощью кПЦР. В этом случае в качестве контроля используют растение, которое содержит данный ген в единственном экземпляре.

6. Преимущества пцр в реальном времени

1. Возможность количественного определения;

2. Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего зонда;

3. Надежность из-за снижения риска контаминации (за счет проведения всех стадий ПЦР в одной пробирке и отсутствия стадии электрофореза);

4. Снижение времени проведения реакции;

5. Возможность создания мультиплексных систем, которые позволяют детектировать несколько возбудителей в одном образце;