Класифікація іфа
У всіх варіантах ІФА вимірюється ферментативна активність міченої сполуки, яка може знаходиться або в складі специфічного імунного комплексу або ж у комплексі із вільними, що не вступили в реакцію, центрами зв’язування.
І). Відповідно до цього принципу ІФА (як і інші індикаторні методи) можна поділити на дві великі групи – в І-ій групі методів визначають специфічні імунологічні комплекси; в ІІ-ій групі – визначають вільні центри зв’язування антитіл чи антигенів.
В першій групі методів ферментна мітка знаходиться в утвореному специфічному комплексі - аналізованого антигену і антитіла (чи навпаки - аналізованого антитіла і антигену). Тому очевидно, що зростання концентрації аналізованої сполуки буде супроводжуватись збільшенням концентрації специфічних імунохімічних комплексів, що при цьому утворилися, а отже і вищим сигналом, який реєструється. Для І групи методів калібрувальний графік будують як залежність зареєстрованого сигналу від концентрації аналізованої сполуки, і він описується зростаючою функцією.
У другій групі методів (тип II) за допомогою ферментної мітки виявляють вільні центри зв’язування, а концентрація імунохімічних комплексів розраховується як різниця між початковою концентрацією центрів зв’язування і виміряною експериментально концентрацією центрів зв’язування , що залишилися вільними. В методах ІІ групи калібрувальний графік є спадаючою функцією.
II) Класифікацію методів ІФА можна проводити по типу реагентів, що використовуються на першій стадії аналізу.
Якщо на першій стадії в системі присутній тільки аналіт (речовина, що досліджується) і відповідні йому центри зв’язування (антигени або специфічні антитіла), то метод називається НЕКОНКУРЕНТНИМ або методом послідовного насичення. При неконкурентних методах вважається, що аналіт уже прореагував із центрами зв’язування до внесення ферментної мітки.
Якщо на першій стадії аналізу в системі одночасно присутні досліджувана речовина і її аналог (мічена ферментом аналізована сполука або аналізована сполука, що іммобілізована на твердій фазі), що конкурують за центри специфічного зв’язування, метод називається КОНКУРЕНТНИМ.
ІІІ). Методи ІФА можна поділити на ПРЯМІ, коли використовують мічені антитіла чи антигени і НЕПРЯМІ, коли використовують мічені антивидові антитіла (специфічні до γ-глобулінів тварин, які використовувались для виготовлення імунної сиворотки до антигену, що досліджується).
В багатьох варіантах ІФА використовують два типи антитіл – одне виконує функцію ліганда (тобто взаємодіє із аналітом) і називається первинним або захоплюючим (captured). Воно може попередньо імобілізуватись на одноразовому носієві. Друге антитіло називається вторинним або індикаторним (determined). Воно є міткою, тобто це кон’югат специфічного антитіла (імуноглобуліна) і ферменту.
Отже фактично імуноферментний сигнал може бути посилено за рахунок використання антитіл декількох порядків:
Антиген (з досліджуваного зразка) імобілізується на твердій фазі. Антиген специфічно розпізнається антитілами 1-го порядку - первинним або захоплюючим (captured), які зв’язуються з ним. Наступним кроком є введення в систему антитіл 2-го порядку - вторинним або індикаторним (determined), які специфічно розпізнають антигенні детермінанти антитіл 1-го порядку. Антитіла 2-го порядку містять ферментну (або іншу) мітку. Оскільки антигенних детермінант у складі молекул 1-го порядку, які розпізнаються антитілами 2-го порядку може бути декілька, то імунна відповідь, і, відповідно, сигнал підсилюється в порівнянні з першою реакцією розпізнавання антигену антитілами 1-го порядку.
Первинні антитіла є специфічними щодо аналізованої речовини. Їх одержують в результаті імунізації тварин конкретними антигенами природного походження або їх синтетичними аналогами.
IV). З точки зору способу виконання всі методи імуноферментного аналізу (ІФА) можна поділити на дві групи:
системи, що не потребують розділення компонентів (гомогенні методи);
системи, для яких таке розділення є необхідним (гетерогенні методи).
В системах, що не потребують розділення (гомогенні)- ферментативну активність розчину, що аналізується, вимірюють без попереднього фізичного відокремлення вільних мічених лігандів від тих, що зв'язані з антитілами. Такий підхід можливий, коли активність мічених лігандів, зв'язаних з антитілами, суттєво відрізняється від активності вільних мічених лігандів.
В методах з відокремленням (гетерогенні) отримують дві окремі фракції міченого ліганду: зв'язану з антитілами і вільну, незв'язану, і лише потім вимірюють активність цих фракцій. Фізичне розділення зв'язаної з антитілами і вільної фракцій є обов'язковим, оскільки аналіз засновано на розподілі мічених кон'югатів між цими фракціями.
В основі більшості методів гетерогенного ІФА лежать принципи, розроблені в імуноаналізі з використанням радіоактивних міток.
Велика різноманітність методів гетерогенного аналізу обумовлена можливістю введення ферментної мітки як у молекулу антигену, так і в молекулу антитіла.
Крім того, для конкретної схеми аналізу визначальним фактором є- який із компонентів - антитіло чи антиген, було використано в іммобілізованому вигляді для розділення імунохімічних комплексів від компонентів, що не зв'язались.
За цим принципом гетерогенні методи можна розділити на методи, що засновані на використанні мічених антитіл і на ті, що базуються на використанні мічених антигенів.
Гетерогенні методи розподіляються по характеру першої стадії- "розпізнавання" на: а) твердофазні, якщо на першій стадії антиген чи антитіло використовують в імобілізованому вигляді, тому утворення специфічного імунного комплексу відбувається відразу на твердій фазі (solid phase method); б) коли на першій стадії специфічний комплекс утворюється в розчині, а з метою розподілу використовують тверду фазу- гомогенно-гетерогенний метод аналізу.