Як хромогенний субстрат також використовується abts- 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid). За умов його застосування оптичну густину проб визначають при 405 нм.

Кількісну інтерпретацію результатів визначення АГ чи АТ здійснюють, як правило на основі калібрувального графіку – по осі Х якого відкладають концентрацію АГ в стандартному препараті, а по осі У – експериментально визначений показник.

Проте використання ПХ має ряд недоліків:

• кон’югати пероксидази з АТ втрачають активність при контамінації мікроорганізмами (при цьому не можна використовувати інгібітори росту бактерій – метанол і азид натрію, оскільки фермент чутливий до їх дії);

• більшість хромогенних субстратів ПХ є сильними канцерогенами.

Аналогічно можна використати субстрати пероксидази (люмінол, ізолюмінол), які можуть бути окислені пероксидом водню в реакції хемілюмінесценції.

Лужна фосфатаза (100 кДа) (англ. АР= alkaline phosphatase) стабільна при зберіганні, резистентна до дії бактеріологічних агентів, більшість її субстратів не становлять біологічної небезпеки. Фермент каталізує гідроліз фосфорних ефірів. Так, наприклад, субстратом при фотометричному визначенні продуктів реакції є 4- нітрофенілфосфат, який перетворюється в 4-нітрофенол, що реєструється за оптичною густиною при 405 нм. За умови використання флуоресцентного субстрату 4- метилумбеллиферилфосфату, реєструється накопичення продукту реакції - 4- метилумбеллиферону, який флуоресціює з високим квантовим виходом при 450 нм, а довжина хвилі збудження - 365 нм.

β-Галактозидаза (англ. galactosidase) каталізує гідроліз лактози з утворенням глюкози і галактози. Якщо замість природного субстрату взяти:

• при фотометричному визначенні - нітрофенілгалактозид, утворюється паранітрофенол, що реєструється за оптичною густиною при 405 нм;

- при флуориметричному визначенні- 4- метилумбеллиферил- β- D-галактозид, утворюється галактоза і 4- метилумбеллиферону, який

флуоресціює з високим квантовим виходом при 450 нм (збудження при

365 нм).

В цілому, важливо відмітити, що час і температура ферментативної реакції повинні бути строго фіксованими і відповідати параметрам, вказаним в інструкції; ферментативна реакція повинна обов’язково зупинятись, зазвичай шляхом додавання кислоти (часто сірчаної). Якщо реакцію не зупинити, то вона буде проходити невизначено довго. Зазвичай підбирають такий варіант кольорової реакції, щоб забарвлена речовина була одночасно і кислотно-лужним індикатором, тому коли реакція заінгібована, колір реакційного середовища змінюється (для ТМВ з синього на жовтий).

Разом з тим, при роботі на автоматичних системах реакцію іноді не зупиняють, але в даному випадку обов’язковою умовою є фотометрія проб через строго фіксовані інтервали часу і одночасно із досліджуваними пробами знімаються показники і з калібрувальних.

Крім ферментів як маркери можуть використовуватись субстрати. Зокрема, в імуноферментному аналізі можуть використовуватись АТФ і НАД⁺. У цьому випадку АТФ і НАД⁺ є "пришитими" до молекули антигену через аденіловий залишок таким чином, що зберігається їх здатність взаємодіяти з ферментом.

КОН’ЮГАТИ. Для проведення ІФА використовують кон’югати антигенів або антитіл (зазвичай антивидових) із ферментами, їх субстратами та кофакторами, білками, антивидовими антитілами, синтетичними полімерами.

Іноді замість антивидових АТ використовують білок А клітинних стінок золотистого стафілокока (Staphylococcus aureus), що зв’язується з Fc-фрагментом першого антитіла в утвореному комплексі (в основному IgG), та білок G клітинних стінок стрептококів (Streptococcus). З використанням молекулярно – біологічних підходів було створено рекомбінантний білок А/G, що поєднує властивості обох білків. Див. також Лекцію РІА.

Ця система може працювати таким чином: для визначення антитіл в сироватці крові на поверхні фіксується антиген, який при інкубації з сироваткою зв’язує специфічним чином АТ з неї. З цими імуноглобулінами зв’язується через Fc-фрагмент білок А, потім додаються специфічні до нього антитіла, які коньюговані з ферментом. Відтворюється класична реакція ІФА. Завдяки цьому одні і ті самі препарати білка А і кон’югатів (антиА-фермент) використовуються для визначення різних антитіл. (Див. Alternatives to аntigen-аntibody reactions у цій же лекції).

На основі використання коферментів з низькою молекулярною масою як мітки для антигенів чи антитіл, досить популярною стала така комплементарна пара як біотин – авідин (білок курячого яйця) або стрептавідин (бактеріальний білок). Біотин є коферментом - вітамін Н, який може певним чином зв'язуватись з імуноглобулінами. В той же час він активно взаємодіє з авідином (стрептавідином).

Якщо можливо ковалентно зв’язати біотин безпосередньо з первинними антитілами (1-го порядку), то стрептавідин мітять ферментом (для подальшої виявлення реакції) і використовують аналогічно до вторинних антитіл (2-го порядку).

Отже, наприклад, до досліджуваного Аг додаються мічені біотином анти-Аг антитіла, після цього додається мічений ферментом авідин. Додається субстрат і проводиться ІФ реакція.

Система “ антиген +антитіло-біотин + мічений стептавідин”

Частіше зараз став використовуватись стрептавідин, який на відміну від зарядженого (+) авідину, є нейтральним, і не має специфічної адсорбції.

Стрепт(авідин) може з’єднуватись з 4 молекулами біотину, тому можливо з’єднання його з молекулою біотину і утворення комплексу АВС (авідин-біотин-комплекс).

Система “антиген + антитіло- біотин + (стрепт)авідин + мічений біотин”:

У цьому випадку утворюється ціла мережа з молекул стрептавідину, зв'язаного з міченим біотином. Відповідно, відбувається багатократне посилення сигналу.

Саме така мережа зображена на першому рис.1, де показано послідовність- до антигену додаються первинні антитіла, потім біотинільовані вторинні антитіла та попередньо сформований комплекс- авідин- біотин-фермент або мічений ферментом стрепт(авідин) (рис. 2). Отже використання вторинних, третинних і т.д. антитіл, як і системи стрепт(авідин) - біотин сприяють значному підсиленню сигналу, що реєструється в імуноферментному аналізі.