Непряма еlisa для визначення ат

Суть його полягає в тому, що антиген сорбують на поверхні лунки полістирольного план­шету. Якщо ан­тигену недостатньо, щоб закрити всі потенційні центри зв'язування, другим кроком лунку блокують нейтральним білком (наприклад, сиро­ватковим альбуміном). Потім додають розчин, що містить досліджувані антитіла. Антитіла зв'язуються з сорбованим антигеном, а ті, що не зв'язалися, відмиваються (спеціальним розчином або просто водою). Тепер не­обхідно виявити антитіла, що зв'язалися. Для цього, як правило, ви­користовують вторинні детектуючі антитіла, мічені ферментом, їх теж інкубують у лунках, відмивають ті, що не зв'язали­ся, а потім додають розчин субстрату. Фермент починає перетворю­вати його, і накопичення забарвленого продукту пропорційне кількості зв'язаних других, а значить, і перших антитіл. У випадку дослідження антитіл сироватки людини вторинні антитіла специфічно розпізнають первинні антитіла (антитіла сироватки людини), що закріплені на антигені (інфекційному агенті).

Еlisa для визначення антигенів

Для визначення антигену поширений також так званий сендвіч-метод, так званий “молекулярний ланцюг”, коли перші антитіла сорбують на пластик, додають пробу, що містить антиген, а потім антитіла до іншої антигенної детермінанти антигену, що також зв'язуються з ним. Ці антитіла можуть бути міче­ними самі по собі або бути проявленими другими міченими антитіла­ми. Кількість зв'язаних "верхніх" антитіл пропорційна кількості антигену в пробі.

Використання других антитіл має своєю метою підсилення кінце­вого сигналу, що реєструється в імуноферментному аналізі, і, від­повідно, підвищення чутливості методу, оскільки з однією молекулою перших антитіл може зв'язатися декілька молекул мічених других антитіл. Якщо використання других антитіл за якихось причин є небажаним, використовують інші ампліфікаційні системи, наприклад, білки А і G або комплементарну пару авідин (стептавідин) –біотин , про які ми говорили.

На цьому ж рис. представлено конкурентний метод визначення рівня антигенів у двох варіантах.

1варіант- на пластик сорбуються антитіла 1-го порядку (captured). Після додавання немічених і мічених ферментом досліджуваних антигенів, вони конкурують за центри зв’язування з антитілами. Після додавання хромогенного субстрату, визначають екстинцію розчину (492 нм). Графік буде спрямований вниз, оскільки зв’язування - конкурентне.

2 варіант- В разі сорбції на поверхні досліджуваного антигену можна додати разом із першими антитілами розчинний антиген, і він буде конкурувати із сорбованим за зв'язування з антитілами, і антитіл на твердій фазі зв'яжеться тим менше, чим більше додано розчинно­го антигену. Додаючи коньюговані з ферментом другі (детектуючі) антитіла та хромогенний субстрат, проводили ферментативну реакцію як і в першому варіанті.

Ще раз нагадую, що кількісну інтерпретацію результатів визначення АГ чи АТ здійснюють, як правило на основі калібрувального графіку – по осі Х якого відкладають концентрацію АГ в стандартному препараті, а по осі У – експериментально визначений показник.

Метод ELISA застосовують для визначення вмісту в кровотоці антитіл проти бактеріальних антигенів, вірусних антигенів, антитіл, що синтезуються при аутоімунних захворюваннях, а також для визначення інших компонентів, таких, як феритин, галактозилтрансфераза, ретинол-зв'язуючий білок, пролактин, лютропін, та багато інших.