Створення кон'югатів
Для зв’язування ферменту з антитілом чи антигеном без втрати ферментативної активності та порушення властивостей антитіл і антигенів використовують біохімічні, метод хімічного зшивання, імунологічні методи, методи генної інженерії.
Найбільш розповсюдженими є біохімічні методи отримання імуноферментних кон’югатів, коли з’єднання АГ чи АТ з ферментною міткою відбувається за рахунок ковалентних взаємодій між вільними реакційно здатними групами -COOH, -NH2 ,-SH, -OH.
Для одержання високоактивних кон’югатів широко застосовується глутаральдегідний метод. Одним з перших реагентів, який використовували для синтезу імуноферментних кон’югатів, був глутаровий альдегід, що реагує з аміногрупами лізину білків. За допомогою глутарового альдегіду було отримано кон'югати антитіл і антигенів з пероксидазою, лужною фосфатазою, глюкоамілазою. Сьогодні широко використовуються імунопероксидазні кон'югати з β-галактозидазою.
Імунологічні або нековалентні методи отримання кон’югантів засновані на використанні антитіл або їх складових як зшиваючих ланок. Найвідоміший з них метод з використанням комплексу фермент- антитіло проти ферменту. Для пероксидази хрону як ферменту-мітки метод ПАП (пероксидаза-антипероксидаза), який запропонував Strernberger в 1979 р. Недоліком методу є часткове інгібування пероксидазної активності при утворенні комплексу зі "своїм" антитілом.
Поширеним імунологічним методом є метод «гібридних антитіл», який включає ряд етапів: спочатку отримують F(ab')2-фрагменти до антигену та ферменту шляхом обробки відповідних антитіл пепсином; далі їх піддають дії відновлюючого агента (найчастіше меркаптоетанолу), внаслідок чого F(ab')2-фрагменти зворотно дисоціюють на симетричні частини. Після вилучення відновлюючого агента відбувається рекомбінація Fab-фрагментів внаслідок чого поряд із вихідними, утворюються гібридні Fab-фрагменти, один активний центр яких специфічний до епітопів антигенів, а інший – до ферменту. При додаванні до таких фрагментів ферменту утворюється кон’югат Fab-фрагмент-фермент.
Метод є досить дорогим. Перспективним сьогодні є метод не- ковалентного введення ферментної мітки, заснований на використанні кон’югатів АТ з лектинами- рослинними білками, які мають здатність специфічно зв’язуватись з вуглеводними залишками, що входять до складу ферментів.
Гібридомна технологія відкриває принципово новий шлях отримання гібридних антитіл, який полягає у злитті моноклональних клітин специфічних проти певного антигену і ферменту-мітки, в результаті чого утворюються гібридоми другого покоління, які синтезують антитіла з двома специфічностями.
Існує ще один метод введення ферментної мітки до складу кон’югату. Отримують антитіла з сироватки крові одного виду тварин (наприклад, кролика) проти досліджуваного антигену і ферменту-мітки. Ці антитіла зв’язуються між собою через антитіла іншого виду тварин (наприклад, антитілами барана проти антитіл кролика). Додавання в розчин з такою потрійною молекулою ферменту-мітки веде до утворення комплексу антитіло-фермент. Сьогодні розробляються експериментальні підходи для отримання гібридних антитіл методами клітинної і генної інженерії, що дозволить суттєво спростити цей процес.
Гетерогенний твердофазний ІФА, який називають „фермент- залежним імуносорбентним аналізом" (ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Цей метод згідно з розглянутою класифікацією може бути прямим (із застосуванням мічених антитіл чи антигенів-тобто для визначення чи АТ, чи АГ) і непрямим (із застосуванням мічених антивидових антитіл), конкурентним і неконкурентним.
Для імуноаналізу антитіл (пряма ELISA)
Антиген в сольовому розчині інкубуємо на пластиковій підложці до моменту його повного адсорбування на поверхні.
Вільний (незв’язаний) антиген видаляємо шляхом відмивання
Додаємо досліджувані АТ, які зв’язуються з АГ.
Незв’язані АТ відмиваємо.
АТ визначаємо з використанням міченого ліганда, який може бути зв’язаним з ферментом- тією ж пероксидазою хрону. Як ліганд-комплекс біотин-стрептавідин.
Незв’язаний ліганд видаляють промивкою.
Візуалізація відбувається після додавання хромогену, що в результаті ферментативної реакції дає забарвлений продукт.
Внизу –фотографія "проявленого" планшету, де показано зниження інтенсивності забарвлення після сканування оптичної щільності при підвищенні титру антитіл.
